靶向Ku70基因siRNA對人肺腺癌細胞順鉑耐藥性的逆轉作用

黎 萍，張 捷，李亞榮，王 珂，蘇振中

(1.吉林大學第二醫院呼吸內科，吉林 長春 130041；2.吉林大學第二醫院血液腫瘤科，吉林 長春 130041)

肺癌中80%～85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，化療是NSCLC臨床治療的主要方法之一，以鉑類為基礎的聯合化療是NSCLC的標準化療方案，而肺癌內在性或獲得性耐藥嚴重影響順鉑的臨床化療效果[1]。肺癌順鉑耐藥機制復雜，與P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶Ⅱ等多藥耐藥因子表達呈正相關[2]；與血清p53抗體及谷胱甘肽S-轉移酶陽性表達呈負相關[3]。近年研究[4-5]表明：DNA修復相關分子以及凋亡信號途徑的異常是肺癌順鉑耐藥的重要機制之一。Ku70是DNA結合蛋白，是DNA磷酸蛋白激酶的重要成分，參與DNA轉錄調節，可獨立參與細胞DNA修復并具有抗凋亡作用[6]。研究[7]表明：Ku70的表達水平與頭頸部腫瘤放、化療后復發率呈正相關，此外Ku70與甲狀腺癌[8]、宮頸癌[9]放療敏感性有關。本研究比較Ku70在人肺腺癌細胞系親代(A549)與人肺腺癌耐順鉑細胞系(A549/DDP)的表達水平，觀察siRNA靶向沉默Ku70后A549/DDP細胞在順鉑作用下的增殖、凋亡情況，特別是耐藥性的變化，以期為肺癌順鉑耐藥提供潛在的分子標志物，為臨床逆轉肺癌順鉑耐藥、提高化療療效尋找有效的分子靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑人肺腺癌細胞系親代(A549)及其耐順鉑細胞系(A549/DDP)均購自第三軍醫大學新橋醫院呼吸病研究所。dNTP、MMV逆轉錄酶購自Promega公司；Ex-Taq、DL-2000 DNA marker為Takara公司產品；MTT、順鉑購自美國Sigma公司；Lipofectin 2000及 Trizol為美國Invitrogen公司產品；胰酶、IMDM培養基為美國Hyclone公司產品；人Ku70抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔多克隆抗體購自Santa-cruz公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒及Caspase-3 分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基公司。PAGE級引物由寶生物(大連)工程有限公司合成；siRNA序列由Ambion公司合成。Ku70siRNA序列為正義鏈5′-GAGUGAAGAUGAGUUGACATT-3′，反義鏈5′-UGUCAACUCAUCUUCACUCTG-3′；無意義的對照序列(Scramble)為：正義鏈5′-GGATTAAGTTCGGATAGT-3′，反義鏈5′-GCCTCTTAT-TCTCGACATCTA-3′。

1.2 細胞培養及分組A549及A549/DDP均在含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液中于37℃、5% CO2的孵箱內培養，以0.25%胰酶消化傳代。A549/DDP依次以半量(0.5 mg·L-1)、全量(1 mg·L-1)順鉑培養液培養各1周。實驗分為空白組(A549/DDP細胞)、陰性對照組[轉染非特異性siRNA(si-Scramble)組]和實驗組[轉染靶向Ku70基因的siRNA(si-Ku70)]。

1.3 A549/DDP細胞轉染siRNA細胞按5×105/孔的密度接種于6孔板中，待細胞融合至70%～90%時進行轉染。轉染前，將待轉染細胞的培養液更換為無血清的培養液。按照脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明書進行轉染。轉染4～6 h后，將細胞培養液換為含10%胎牛血清的培養液。加藥組在轉染后48 h加6 mg·L-1順鉑。各組均在轉染后72 h收集細胞。

1.4 RT-PCR檢測Ku70 mRNA的表達采用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄按照RT-PCR試劑盒說明書進行，PCR反應體系中加入引物分別為：Ku70基因引物(產物為371 bp)，上游序列為5′-CTGTGCCAACCTCTTTAGTGATG-3′,下游序列為5′-TGGTTCATTTGTTTCCCGATA-3′；GAPDH基因引物(產物為500 bp)，上游序列為5′-GATTGTTGCCATCAACGACC-3′，下游序列為5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′。PCR反應條件：95℃預變性90 s;94℃、30 s，54℃、30 s，72℃、30 s，30個循環；72℃延伸10 min。PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內參，計算各目的基因的相對密度值。實驗重復3次，計算光密度(A)值的均值與標準差；以目的基因的相對A值間接表示基因的mRNA表達水平。

1.5 Western Blotting法檢測Ku70蛋白的表達分別提取各組細胞的總蛋白，蛋白定量后，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加入抗人Ku70多克隆抗體雜交，再加入HRP-偶聯二抗，按ECL試劑盒說明書發光、曝光。以GAPDH為內參照，計算目的蛋白的相對A值。實驗重復3次，計算A值的均值與標準差。以目的蛋白的相對A值間接表示蛋白含量。

1.6 MTT法檢測細胞生存率取對數生長期A549/DDP細胞，以2×104/孔接種于96孔板。各組細胞加入50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5及0 mg·L-1濃度梯度的順鉑，每個濃度設4個復孔；培養24 h后行MTT法檢測，用酶標儀測570nm波長的A值，計算細胞生存率。細胞生存率(%)=實驗組A值/陰性對照組A值×100%。采用線性回歸計算順鉑對各組細胞的半數抑制濃度(IC50)。

1.7 分光光度法檢測各組細胞的Caspase-3活性采用Caspase-3活性分光光度法檢測試劑盒，取50 μL 含100 μg 蛋白的細胞裂解上清，按照試劑盒說明書進行操作，加入5 μL Caspase-3底物并于37℃ 避光孵育4 h后，用酶標儀測定405 nm處的A值。通過計算實驗組的A值/陰性對照A值的倍數來確定Caspase-3活化程度。

1.8 流式細胞術檢測細胞的凋亡率取1×106個細胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光反應15 min；在1 h內行流式細胞儀檢測分析各組細胞的凋亡率。儀器參數為：激發波長(Ex)=488 mn，發射波長(Em)=530 nm。

2 結 果

2.1 Ku70在A549/DDP細胞系與親代A549細胞系中的表達差異與親代A549細胞系Ku70 mRNA表達水平(0.752±0.028)比較，A549/DDP細胞系Ku70 mRNA表達水平(0.987±0.019)明顯增高(P<0.01)。見圖1A。與親代A549細胞系Ku70蛋白表達水平(1.042±0.058)比較，A549/DDP細胞系Ku70蛋白表達水平(1.287±0.031)明顯增高(P<0.01)。見圖1B。

圖1 Ku70在A549及A549/DDP細胞的mRNA(A)及蛋白(B)表達水平

2.2 轉染siRNA后各組細胞Ku70的表達水平實驗組(si-Ku70)Ku70 mRNA表達水平(0.985±0.018)明顯高于空白對照組(0.885±0.076)及陰性對照組(0.385±0.058)(P<0.01)。見圖2A。以GAPDH做內參，實驗組Ku70蛋白表達水平(0.389±0.011)低于空白對照組(1.256±0.078)與陰性對照組(1.291±0.047)(P<0.01)。見圖2B。

2.3 轉染后各組細胞的生存率及IC50在不同濃度順鉑作用24 h后，實驗組細胞的生存率明顯低于陰性對照組與空白對照組。見圖3。根據此結果，計算各組IC50值。實驗組IC50為(8.73±0.62) mg·L-1，較空白對照組[(37.21±4.17) mg·L-1]和陰性對照組[(37.07±3.81) mg·L-1]顯著降低(P<0.01)。

圖2 轉染siRNA后A549/DDP細胞中Ku70 mRNA(A)及蛋白(B)表達水平

2.4 細胞凋亡的變化6 mg·L-1順鉑作用24 h后，流式細胞術檢測結果表明：實驗組細胞凋亡率(23.16%±4.29%)高于陰性對照組(11.35%±2.68%)和空白對照組(9.56%±4.29%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。Caspase-3活性檢測表明：實驗組細胞Caspase-3活性高于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖3 MTT法檢測順鉑作用后各組細胞生存率的變化

圖4 流式細胞術檢測6 mg·L-1順鉑作用后各組細胞的凋亡率

表1 分光光度法檢測6 mg·L-1順鉑作用后各組細胞Caspase-3活性

3 討 論

肺癌順鉑耐藥機制復雜，目前的研究[2-5]已經證實：DNA損傷修復、增殖與凋亡信號途徑相關的細胞內蛋白功能改變與肺癌順鉑耐藥密切相關。Ku蛋白是DNA重組修復系統中最重要的組成部分，在DNA雙鏈斷裂(double strand DNA breaks,DSBs)的同源重組和非同源末端結合修復途徑中發揮重要作用[10]。Ku70是Ku蛋白的組成成分之一,具有多種生物活性，參與DNA轉錄調節，可獨立參與細胞抗凋亡，尤其是在DSBs的非同源末端結合修復途徑中發揮重要作用[6]。本研究表明：人肺腺癌細胞耐藥細胞系A549/DDP Ku70 mRNA和蛋白表達水平顯著高于其親代非耐藥細胞系，提示Ku70的表達與肺癌耐藥直接相關；靶向導入Ku70 siRNA封閉A549/DDP細胞的Ku70基因，根據本實驗MTT結果及文獻[11]方法，本研究采用6 mg·L-1順鉑作用于各組細胞，實驗組細胞生存率與陰性對照組及空白對照組比較明顯下降；實驗組順鉑IC50明顯下降，提示靶向封閉Ku70可以逆轉耐藥的人肺腺癌細胞對順鉑的耐藥性；Ku70 siRNA與順鉑有協同作用，有助于在靶向聯合治療中減少順鉑用量，有助于減少劑量相關副作用。本研究中凋亡檢測結果表明：在6 mg·L-1順鉑作用下，實驗組細胞凋亡率明顯增加、細胞凋亡級聯反應下游的凋亡執行蛋白水解酶Caspase-3的活化程度明顯增加，提示靶向封閉Ku70能增加耐藥細胞對順鉑誘導的凋亡的敏感性，從而逆轉肺腺癌順鉑耐藥。本文作者[12]曾對未封閉Ku70的A549/DDP細胞和靶向導入Ku70 siRNA封閉Ku70后的A549/DDP細胞進行凋亡相關基因組的PCR Array檢測，結果表明：沉默Ku70后A549/DDP細胞促凋亡基因BAX、P53、P73的mRNA表達水平明顯上調，而抗凋亡基因TRAF、BFAR表達水平下調，提示靶向沉默Ku70逆轉肺癌細胞耐藥與促凋亡基因組的表達上調直接相關。有研究[13]表明：Ku70蛋白能與促凋亡蛋白BAX結合并抑制BAX介導的凋亡；且該過程獨立于其二聚體的Ku86。Gama等[14]研究表明：凋亡細胞的Ku蛋白表達水平下降；而對順鉑處理的宮頸癌細胞系Hela細胞的研究[15]表明：靶向Ku70 siRNA下調Ku70表達，可抑制Hela細胞增殖，促進凋亡，與本研究結果類似。Ku70可能通過加速DNA修復、抗凋亡增加人腺癌耐藥細胞對順鉑的敏感性，其具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，Ku70在人肺腺癌耐順鉑細胞系中呈高表達狀態，靶向封閉Ku70可逆轉其肺腺癌耐藥，并推測Ku70可能通過調控凋亡基因的表達引起凋亡耐受，斷裂DNA修復加速，參與肺癌細胞耐藥的形成。本研究結果提示：Ku70可能成為臨床監測腫瘤耐藥性變化的標志物之一及逆轉肺癌耐藥的一個新的分子靶點。

[參考文獻]

[1]Azzoli CG，Baker S，Temin S，et al.American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update on Chemotherapy for Stage Ⅳ Non-Small-Cell Lung Cancer [J].J Clin Oncol，2009，27(36)：6251-6266.

[2]史 鵬，劉 晶，趙鳳芹，等.非小細胞肺癌多藥耐藥因子的表達相關性及臨床意義[J].吉林大學學報：醫學版，2007，33(1)：151-154.

[3]劉智鑫，劉國津.人非小細胞肺癌細胞藥物敏感性檢測及其與耐藥因子p53抗體和GSTZ表達的關系[J].吉林大學學報：醫學版，2005，31(5)：798-795.

[4]Liu HY，Liang YG，Li Y，et al.Gene silencing of BAG-1 modulates apoptotic genes and sensitizes lung cancer cell lines to cisplatin-induced apoptosis[J].Cancer Biol Ther，2010，9(10)：832-840.

[5]劉 萍，王豪勛.非小細胞肺癌組織中RRM1的表達與含吉西他濱方案耐藥的關系[J].鄭州大學學報：醫學版，2011，46(6)：876-878.

[6]Rathaus M，Lerrer B，Cohen HY.DeubiKuitylation：A novel DUB enzymatic activity for the DNA repair protein,Ku70[J].Cell Cycle，2009，8(12)：1843-1852.

[7]Pavon MA,Parreno M,Leon X,et al.Ku70 predicts response and primary tumor recurrence after therapy in locally advanced head and neck cancer[J].Int Cancer,2008,123(5):1068-1079.

[8]王奇金，鄒大進.Ku70反義寡核苷酸增強甲狀腺癌細胞的輻射敏感性[J].中華內分泌代謝雜志，2009，25(5)：544-545.

[9]張 妍，尹 元.RNA干擾Ku70基因對宮頸癌Hela細胞放射敏感性影響的實驗研究[J].中國實驗診斷學,2010,14(12):1916-1920.

[10]Fell VL，Schild-Poulter C.Ku regulates signaling to DNA damage response pathways through the Ku70 von willebrand A domain[J].Mol Cell Biol,2012,32(1): 76-87.

[11]Jaya S，Analisa D，Lauren F，et al.Targeted reduction of KLF6-SV1 restores chemotherapy sensitivity in resistant lung adenocarcinoma[J].Lung Cancer，2009，66(3)：292-297.

[12]李亞榮，張 捷，王 珂，等.沉默Ku70后人耐藥肺癌細胞凋亡基因組表達變化及臨床意義[J].中國免疫學雜志，2010，26(4)：312-316.

[13]Sawada M，Sun W，Hayes P，et al.Ku70 suppresses the apoptotic translocation of Bax to mitochondria[J].Nature Cell Biol，2007，9(4) : 480-480.

[14]Gama V，Yoshida T，Gomez JA，et al.Involvement of the ubiquitin pathway in descreasing Ku70 levels in response to drug-induced apoptosis[J].Exp Cell Res，2006，312(4)：488-499.

[15]Tian X，Chen G，Xing H，et al.The relationship between the down-regulation of DNA-PKcs or Ku70 and the chemosensitization in human cervical carcinoma cell line HeLa[J].Oncol Rep，2007，18(4):927-932.