低劑量力達霉素對小鼠P19胚胎癌細胞的生長抑制作用及其機制

李 映，王 暢，譚業輝，甄紅英，姚 程

(1.吉林大學第一醫院腫瘤中心,吉林 長春130021；2.北京大學基礎醫學院細胞生物學系，北京 100191)

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病之一，現已在我國疾病死亡中躍居首位。腫瘤的顯著特征是無節制的生長，其細胞組成呈現異質性。腫瘤干細胞理論認為：原發腫瘤組織中僅有一小部分的未分化細胞移植在裸鼠中能夠形成腫瘤，稱為腫瘤干細胞，而其他大部分細胞不具備成瘤性[1]。對治療反應敏感的腫瘤，傳統的化療和放療雖能殺傷腫瘤中的大部分細胞，但如有極少數腫瘤干細胞殘留，就會成為腫瘤復發和轉移的根源，直接影響患者的生存率[2]。因此，腫瘤干細胞是腫瘤有效治療的新靶點[3]。力達霉素(lidamycin,LDM)原名C1027，是從我國湖北省潛江縣土壤中分離出的一株鏈霉菌StreptomycesglobisporusC-1027產生的大分子烯二炔類抗腫瘤抗生素[4]。已經證實力達霉素在體內外均可通過誘導細胞周期停滯和細胞凋亡，抑制大多數腫瘤細胞的生長[5]。但是，力達霉素抑制靶向細胞生長的分子機制仍不是很清楚。Oct4為Pit-Oct-Une(POU) 轉錄因子家族成員[6]，這種DNA結合蛋白，通過結合保守結構域ATGCAAAT，在正常的成人干細胞、一些實體瘤細胞[3]和囊胚內細胞團細胞中高表達[7]。有研究[2]表明：過表達胚胎干細胞樣基因Oct4與腫瘤干細胞和腫瘤預后有關。本文作者探討力達霉素對小鼠胚胎癌P19細胞生長影響及其可能的作用機制，旨在為以腫瘤干細胞為靶點的腫瘤治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑力達霉素由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所甄永蘇院士提供。阿霉素為美國Sigma公司產品。DMEM/高糖培養基為美國Gibco公司產品，胎牛血清為美國Hyclone公司產品,四氮甲唑藍(MTT)為美國Sigma公司產品。

1.2 細胞培養小鼠胚胎腫瘤P19細胞在含有7.5%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于5% CO2、 37 ℃培養箱內培養。

1.3 細胞生長分析將細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，力達霉素和阿霉素分別在劑量為10-16～10-7mol·L-1及10-16～10-4mol·L-1濃度范圍內處理細胞，48 h后MTT法進行檢測。每孔加20 μL的MTT溶液(5 g·L-1)。在37℃孵箱中培養4 h后，加100 μL DMSO終止反應。每孔的吸光度(A)值可于酶標儀(BIOTEK,Rockville,Mass.,USA)490 nm處測得。將2～3×103個/孔P19細胞鋪于96孔板中，根據劑量曲線選取力達霉素的3個濃度(0.001、 0.01和0.1 nmol·L-1)處理細胞，分別在加藥前、給藥后24、48、72、96和120 h行MTT法檢測，繪制生長曲線。細胞存活率(%)=(處理組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡與細胞周期①凋亡分析：將密度為5.0×104的P19細胞接種于60 mm 平皿中，在4、12、24、48和72 h分別給予1×10-11mol·L-1的力達霉素及0.5×10-6mol·L-1的阿霉素進行處理后收集細胞；首先保留培養上清液，用PBS清洗細胞2次，胰酶消化，將細胞收集在離心管中，并進行離心；PBS清洗細胞2次，每管加入AnnexinⅤ-FITC(北京寶賽生物技術有限公司)，冰浴15 min，再加入PI后立即行流式細胞儀(BD,USA)檢測。②細胞周期檢測：2.0×104個P19細胞接種于60 mm皿中。在無血清的DMEM培養液中培養24 h，使其同步化。然后在培養液中加入7.5%血清，分別加入力達霉素和阿霉素繼續培養24、48和72 h。收集細胞，PBS清洗細胞2次，然后加500 μL 的70%甲醇4℃放置1 h；PBS清洗細胞，加入含50 mg·L-1RNAase A的PBS重懸細胞，37 ℃孵育30 min后加入2 g·L-1PI,于流式細胞儀檢測。

1.6 免疫熒光染色將P19細胞接種于24孔板里，加入非凋亡劑量的力達霉素和阿霉素處理，繼續培養48 h；PBS清洗細胞后，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗細胞后，加含0.2% Triton X-100的PBS打孔15 min，用PBS清洗后，加入適量2%牛血清白蛋白，37℃孵育30 min阻斷非特異性反應。加入一抗Oct4 (1∶100) (Santa Cruz)和 SSEA1(1∶100) (Santa Cruz)室溫孵育過夜。PBS清洗，加二抗，為抗兔TRITC標記的IgG(1∶100)，避光，37℃放置1 h,PBS清洗，DAPI染核，共聚焦顯微鏡照相。

1.7 免疫印跡法用細胞裂解液(鼎國生物)裂解細胞后，將等量的蛋白于10%SDS-PAGE進行電泳，電轉至硝酸纖維素膜(Pierce)，5%奶粉/PBST封閉，用含1‰Tween的PBS(PBST)洗3次，加入特異性鼠源性抗體Oct4(1∶500)和Actin (Santa Cruz Biotechnology,CA) (1∶500),4℃過夜，PBST清洗3次后，加二抗羊抗鼠IgG抗體 (IRDye 700;LI-COR) 室溫孵育1 h，然后于LI-COR Odyssey成像儀上顯像。

2 結 果

2.1 力達霉素對P19細胞生長的抑制作用通過MTT法評價力達霉素對小鼠P19胚胎癌細胞生長的抑制作用，力達霉素對靶細胞生長抑制呈現劑量和時間依賴方式。見表1～3。分別用0.01 nmol·L-1力達霉素和0.5 μmol·L-1的阿霉素處理P19細胞后，流式細胞術檢測凋亡時，僅在藥物處理細胞的早期(4 h)可以看見凋亡細胞，12～72 h在上清液中均未檢測到凋亡細胞(圖1)；流式細胞術檢測細胞周期顯示:0.01 nmol·L-1力達霉素處理P19細胞48～72 h可引起G1期阻滯；0.5 μmol·L-1阿霉素處理P19細胞可引起G2/M期阻滯，見表4。各時間點與0點時比較差異均有統計學意義 (P<0.05)。

表1 不同濃度力達霉素作用后P19細胞生長抑制的變化

表2 不同濃度阿霉素作用后P19細胞生長抑制的變化

2.2 低劑量力達霉素抑制胚胎干細胞樣基因Oct4表達RT-PCR結果顯示:與未加藥處理和阿霉素處理過的P19細胞比較，力達霉素處理過的P19細胞中的Oct4基因表達明顯下調。免疫印跡實驗和免疫熒光染色實驗均進一步從蛋白水平證實，與未加藥物處理和阿霉素處理過的細胞比較，力達霉素處理過的P19細胞中的Oct4表達下調,差異均有統計學意義 (P<0.05)。見圖2和3(插頁三)。

表3 不同濃度力達霉素作用不同時間后P19細胞生長抑制的變化

表4 力達霉素和阿霉素作用不同時間后P19細胞周期的變化

圖1 低劑量力達霉素作用后P19細胞凋亡及細胞周期的變化

圖2 各組P19細胞Oct4的表達水平

3 討 論

力達霉素是一種由一個酸性蛋白和一個發色團組成的抗腫瘤抗生素，其不穩定發色團可以直接斷裂DNA雙鏈[8]，酸性蛋白可作為載體靶向腫瘤組織[9]。力達霉素具有極強的殺傷腫瘤細胞的作用，本實驗結果證實：力達霉素對靶細胞的生長抑制作用明顯強于阿霉素，且較低濃度的力達霉素處理細胞后，仍可有效抑制P19胚胎癌細胞生長。P19胚胎癌細胞是從C3H/He鼠胚胎來源的畸胎瘤中分離得到的，具有與多能性的胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES cell)極為相似的生物學特征，高表達囊胚內細胞團的標記物，如轉錄因子Oct4，是研究腫瘤及細胞分化的理想模型[10]。P19細胞在體外經視黃酸(retinoi acid,RA)或者DMSO誘導，具有向神經元及心肌分化的能力[11]。P19細胞經誘導分化后其胚胎干細胞的標志物Oct4表達降低。Oct4是維持胚胎干細胞自我更新和多能性的一種關鍵轉錄因子[12]，其在全能性或多能性的干細胞及一些實體瘤細胞中高表達[13]，但是在正常體細胞和正常成人干細胞分化的子細胞中不表達。本實驗結果顯示：應用低劑量的力達霉素處理小鼠P19胚胎癌細胞后，導致細胞生長周期在G0/G1期發生阻滯而不引起凋亡，RT-PCR、免疫印跡實驗和免疫熒光染色實驗進一步證實,經低劑量力達霉素處理過的小鼠P19胚胎癌細胞Oct4的表達水平下降，而阿霉素無此作用，結果表明低劑量力達霉素對小鼠P19胚胎癌細胞生長的抑制作用與其抑制胚胎干細胞樣基因Oct4表達可能有關,這與RA作為一種公認的誘導分化劑下調靶細胞中Oct4表達水平作用相似，故認為低劑量力達霉素具有一定的誘導分化的作用。本研究結果也支持Oct4陽性細胞代表了一些腫瘤干細胞的特征以及以胚胎干細胞樣基因Oct4作為腫瘤治療靶點的觀點，為力達霉素作為研究胚胎干細胞增殖和分化方面的有利工具提供可靠依據。目前，力達霉素抑制Oct4表達的機制仍不清楚，需在今后的研究中進一步探討。

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