端粒酶抑制劑對骨肉瘤細胞株增殖的抑制作用

萬法青,王 井,單玉興，張海玉

(1.吉林大學第一醫院二部骨科，吉林 長春 130031；2.吉林大學第一醫院兒外科，吉林 長春 130021)

端粒酶是一種特殊的逆轉錄酶，能以自身RNA為模板合成端粒DNA序列，其結構和行為的異常被認為與細胞衰老及腫瘤發生發展有密切關系。目前有研究[1]表明：85%～95%的惡性腫瘤均有端粒酶的活性表達，而大多數體細胞無端粒酶活性。因此端粒酶可能成為治療腫瘤的新靶點。有學者[2]提出了以抑制端粒酶活性為目標的腫瘤基因治療方案，希望能開發出抑制端粒酶活性或基因表達的抑制劑，從而達到治愈腫瘤的目的。骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，在原發性骨腫瘤中發病率最高，約占35%[3-4]，好發于青少年，是青少年死亡率和致死率最高的骨惡性腫瘤。近年來骨肉瘤化療藥物研究取得了一定的進展[5-6]，但常因耐藥問題及副作用而影響療效，端粒酶的發現及其最新研究為骨肉瘤治療提供一種新的方法。齊多夫定(zidovudine,AZT)是一種核苷類似物，具有抗艾滋病作用，同時還可作為一種端粒酶抑制劑。國內外有文獻[7-10]報道：AZT可以抑制肝癌細胞、人腦膠質瘤細胞、肺癌細胞和結腸癌細胞的端粒酶活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖，并可使HeLa細胞的端粒發生不可逆變的縮短,而AZT在骨肉瘤方面應用的報道卻很少。本實驗應用AZT作用于骨肉瘤細胞株(HOS)，觀察其對腫瘤細胞生長及端粒酶活性的作用，旨在為端粒酶抑制劑更好地應用于骨肉瘤及其他腫瘤的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及主要儀器人骨肉瘤細胞株(HOS)購自北京鼎國生物；MEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；AZT為Sigma公司產品；四氮甲唑藍(MTT)和BCA蛋白試劑盒為碧云天公司產品；TRAP-PCR-ELISA試劑盒為德國寶靈曼公司產品。

1.2 細胞培養及分組HOS細胞培養于含10%胎牛血清的MEM培養基中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。取對數生長期的HOS細胞分為AZT組和陰性對照組,分別加入100 μL經培養液稀釋的不同濃度(1、10、100及1 000 μmol·L-1) AZT及相同體積培養液，培養24、48和72 h后觀察各項指標。

1.3 細胞形態學觀察在MTT實驗中，加藥前后用倒置相差顯微鏡觀察各組培養孔內細胞形態結構的變化。

1.4 MTT比色分析法取對數生長期細胞(制備細胞懸液為1×106mL-1)，接種于96孔板，每孔100 μL。設立實驗組和對照組，次日分別加入100 μL經培養液稀釋好的不同濃度(1、10、100及1 000 μmol·L-1)的AZT及相同體積的培養液，每個濃度設3個復孔，分別培養24、48和72 h后加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續培養4 h，吸棄培養液，每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，終止培養，室溫振蕩約10 min，充分溶解藍紫色結晶。用Model-450酶標儀(Bio-Bad)測定波長490 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%，細胞抑制率(%)=1-細胞存活率，抑制率達到50%為最佳作用時間和濃度,并作為下一步測定端粒酶活性改變的藥物濃度和作用時間。

1.5 TRAP-PCR-ELISA方法檢測端粒酶活性按試劑盒說明操作，具體步驟如下：收集細胞沉淀用冷洗液懸浮，冰浴5 min，4℃、10 000 r· min-1離心5 min，棄上清。沉淀與冷的裂解緩沖液冰浴30 min，其間渦旋振蕩3～5次，4℃、13 000 r·min-1離心 30 min，上清即所需的提取液，吸取上清液至一經DEPC水處理的EP管中，分裝，20 μL/管，BCA法測定其中一份蛋白濃度，其余-70℃保存備用。TRAP-PCR反應：在0.2 mL擴增管中依次加入25 μL反應混合物，3 μL細胞裂解產物，加無菌水至終體積50 μL。PCR步驟：25℃、30 min引物延伸；94℃、5 min端粒酶滅活；94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、90 s，共循環36個周期后72℃、10 min 進一步延伸。4℃保存PCR產物。ELISA反應:PCR產物與變性劑以及雜交緩沖液反應后，取100 μL加入有親合素包被的反應孔中37℃振蕩孵育2 h。洗滌后，于各孔中加入抗地高辛-過氧化物酶，室溫下振蕩30 min。洗滌，再依次加入TMB和終止液，從酶標儀上讀取其在450 nm處的A值。以65℃水浴10 min加熱滅活的HOS細胞提取液作為陰性對照，陽性對照由試劑盒內提供。端粒酶活性下調率(% )=(實驗組平均A值-對照組平均A值) /對照組平均A值×100%。

2 結 果

2.1 細胞形態學變化倒置顯微鏡下觀察對照組細胞貼壁生長，呈短梭形，細胞排列緊密，核較大，細胞密集時呈多層生長，細胞增殖狀態良好；1 μmol·L-1AZT作用HOS細胞48 h后，細胞體積變小，細胞間隙變寬，可見少量細胞由瓶壁脫落并懸浮于培養液中，并可見少量細胞碎片，上述改變隨著AZT濃度的增加及時間的延長而更加明顯。HOS細胞與100 μmol·L-1AZT作用24 h后,細胞體積變小，由短梭形變為多角形或不規則形；48 h后細胞形態改變最顯著，細胞體積進一步變小，細胞數量減少，部分貼壁的細胞皺縮并與鄰近細胞脫離，且瘤細胞大小不一，多呈單層生長；72 h后細胞數量進一步減少，細胞變圓，皺縮，大部分細胞漂浮。見圖1(插頁三)。

2.2 AZT作用后HOS細胞存活率的變化不同濃度AZT對HOS細胞分別作用24、48和72 h后，細胞生長明顯抑制。以1、10、100和1 000 μmol·L-1AZT分別處理HOS細胞24、48和72 h后細胞存活率見表1。以對照組增殖率為(100.000±0.000)%，將不同濃度組的不同時間與對照組相比顯示：AZT可以明顯抑制HOS細胞的增殖，且抑制作用隨著濃度的增加及作用時間的延長而增強(P<0.05)，呈時間和濃度依賴性。AZT對HOS細胞的半數致死濃度(IC50)為100 μmol·L-1。

2.3 AZT作用后端粒酶活性的變化對照組A值為1.236±0.22，AZT組A值為0.547±0.07。AZT組A值與對照組比較明顯降低(P<0.05)，AZT作用后HOS細胞端粒酶活性下降了55.74%,表明AZT對HOS細胞端粒酶活性有明顯的抑制作用。

表1 AZT作用后HOS細胞的存活率

3 討 論

端粒酶是細胞內一種核糖蛋白，主要由RNA成分(hTR)、端粒酶相關蛋白(hTEP)和催化亞單位 (hTERT)3部分組成[11]。其能以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長，以補償細胞分裂時染色體末端的縮短，解決“末端復制問題”，進而穩定端粒長度使細胞達到永生化。因此，抑制端粒酶活性在腫瘤治療中有重要作用。近年來有研究[12]報道：在84%的骨肉瘤、60%的軟骨肉瘤中可檢測到端粒酶活性的表達，而在瘤旁正常組織中卻檢測不到，這表明端粒酶活性是惡性腫瘤細胞的一種標志，也表明抑制端粒酶活性可能成為治療骨肉瘤的一個新靶點。AZT作為端粒酶抑制劑可以和正常的單核苷酸競爭與RNA模板結合并抑制細胞內部逆轉錄酶的活性，在DNA復制時亦可摻入繼而使復制過程中止[13]。有研究[14]發現:AZT能抑制惡性腫瘤的端粒酶活性，縮短端粒，從而抑制腫瘤細胞的增殖和生長。本研究中端粒酶活性下調率為55.74%，與AZT對體外培養的肝癌細胞、大腸癌細胞及肺癌細胞的端粒酶活性下調率一致[15]；1 μmol·L-1AZT作用于HOS細胞24 h后細胞增殖即受到抑制，該劑量遠遠低于其在舌癌等細胞的應用劑量，表明骨肉瘤細胞對AZT較敏感；隨著時間的延長及濃度的增加抑制作用增強，100 μmol·L-1AZT作用于HOS細胞72 h時抑制率達到50%，當1 000 μmol·L-1AZT作用于HOS細胞72 h時抑制率達到最高(90.92%)。有文獻報道：AZT可以阻滯腦膠質瘤細胞處于G1期，干擾逆轉錄過程從而抑制腦膠質瘤細胞生長，AZT對HOS細胞增殖抑制作用的具體機制還有待進一步的研究。

本實驗結果表明：AZT對HOS細胞生長有明顯的抑制作用，且呈時間和濃度依賴性，AZT具有抗骨肉瘤作用，有望成為治療骨肉瘤的一種新藥。

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