125I粒子對體外培養的A549細胞系和人胚肺二倍體細胞系2BS細胞生長的影響及臨床安全使用劑量評估

邊文超,戚良晨

(吉林大學中日聯誼醫院胸外科,吉林 長春 130033)

125I粒子是一種人工同位素，主要產生γ射線，破壞腫瘤細胞核的DNA雙鏈，經過足夠的劑量和足夠的半衰期，能使腫瘤細胞全部失去繁殖能力，從而達到較徹底的治療效果。125I粒子組織間植入治療惡性腫瘤最早應用于前列腺癌，后逐漸應用于肺癌、消化道腫瘤、鼻咽癌及顱內腫瘤[1-3]等，取得了較好的療效。近10年來，125I粒子組織間植入近距離治療肺癌的臨床應用發展較快，植入技術日趨成熟，國內外有學者[4-7]已對125I粒子植入治療非小細胞肺癌的療效和安全性進行了探索，初步結果尚滿意，這種療法具有并發癥少、植入方式靈活、單個粒子射線量低、易于防護等優點，有良好的發展前景。但目前國內外還未見125I粒子對肺癌及正常肺組織影響的基礎研究報道。臨床應用的劑量均是借鑒治療前列腺癌的劑量或參照外放射治療的劑量移植而來，治療劑量的確定缺乏理論依據。因此本文作者通過觀察不同劑量125I粒子對體外培養的人肺癌A549細胞系及人胚肺二倍體細胞系2BS生長的抑制作用，對比125I粒子對腫瘤細胞及正常肺細胞影響程度的不同，并分別繪制細胞生長曲線，以確定治療非小細胞肺癌的適當劑量。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及實驗分組人肺癌細胞系A549及人胚肺二倍體細胞系2BS，購自中國科學院上海生命科學研究院，在含15%熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養基(Gibco公司)，5%CO2、37℃培養箱中培養。放射性粒子6711型125I購自中國原子能科學院北京原博生物醫學工程有限公司。本實驗選用0.2、0.4及0.8 mCi125I粒子分為低、中、高劑量組，以無粒子組、空粒子組分別作為陰性對照組及空白組。

1.2 單層細胞的培養傳代鏡下觀察細胞生長密度達80%以上時需要傳代。吸出培養皿中廢液，2 mL PBS沖洗，加進混入EDTA 1∶1比例的胰蛋白酶2 mL，放入CO2孵育箱(溫度37℃，濕度5%)孵育2～3 min。貼壁細胞脫落后，及時用10%RPMI-1640培養液2 mL終止酶作用，鏡下觀察形成單個細胞懸液。然后離心，棄上清，重新加入10% RPMI-1640培養液懸浮細胞沉淀混勻，用細胞記數板鏡下記數估算濃度，一般在5×105mL-1為佳，重新加入培養皿中，加適當10%RPMI-1640培養液繼續培養。

1.3 細胞凍存方法為保持細胞活力及數量，一般在細胞生長對數期進行凍存。培養傳代細胞生長進入對數期后，離心，棄上清，加入適量凍存液(無血清10%RPMI-1640培養液∶胎牛血清∶DMSO為7∶2∶1)，分裝在1.5 mL凍存管中，放入4℃冰箱，半小時后移置-20℃冰箱隔夜，最后放入-80℃冰箱或液氮罐長期保存。

1.4 細胞排染實驗細胞損傷或死亡后細胞膜完整性破壞。正常細胞拒染而死亡細胞則染成藍色。取100 μL細胞懸液加等量0.4%臺盼藍染色液，混合均勻，滴入血球計數板，穩定2 min后進行觀察，在5 min內計數200個細胞?；罴毎蝗旧劳黾毎仕{色。將細胞生長抑制率[細胞生長抑制率= (對照組活細胞數-實驗組活細胞數)/對照組活細胞數×100%]為Y軸，藥物濃度為X軸作圖，繪出劑量反映曲線，計算半數抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)值。

1.5 繪制細胞生長曲線選用對數生長期的腫瘤細胞3×104mL-1于35 mm平皿。細胞置于5%CO2、37℃溫箱中培養過夜，次晨皿上平鋪0.75%瓊脂，厚度約為0.5 cm，不同劑量125I粒子置入平皿中央。在第2、4、6及8天收集細胞，臺盼藍染色，計數活細胞。每種處理于每個時間點設3個平行組，求均值及標準差，繪制細胞生長曲線。

2 結 果

2.1 體外細胞顯微鏡下觀察結果置入125I粒子后第4天，高劑量組125I粒子附近區域出現區域性低密度區。低及中劑量組未見明顯變化。第6天，在高劑量組125I粒子周圍0.8 cm范圍內可見明顯細胞密度減少，細胞間隙增大，部分區域接近空白。此時，在中劑量組中可見125I粒子附近區域出現較明顯的區域性低密度區，低劑量組可見125I粒子附近區域出現輕微的密度減低區，對照組及空白劑量組中未見明顯細胞密度變化。

2.2 A549細胞和人胚肺二倍體細胞2BS生長曲線A549細胞在整個觀察期內空白組、低劑量組和對照組的增殖趨勢極為接近，而中、高劑量組細胞增殖明顯受抑制，在第6天時最為明顯；對照組，空白，低、中及高劑量組細胞數(×104mL-1)分別為55.23±1.62、51.16±1.81、33.41±1.24、21.62±0.41及6.51±0.39，對照組細胞數分別為空白，低、中、高劑量組的1.079、1.653、2.554和8.484倍。中、高劑量組與對照組、空白組及低劑量組比較差異有統計學意義 (P<0.05)。見圖1A?？瞻?，低、中劑量組和對照組的2BS細胞在整個觀察期內增值趨勢極為接近；高劑量組的增值速度略有減緩。與A549細胞比較，在第6天這種減緩細胞增殖的作用并不十分明顯，對照組，空白，低、中、高劑量組細胞數(×104mL-1)分別為19.21±1.32、18.98±0.59、18.63±0.38、17.58±0.54及15.62±0.41；對照組細胞數分別是空白，低、中、高劑量組的1.012、1.031、1.092和1.230倍。各組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1B。

A

B

2.3 A549和2BS細胞IC50的計算結果低、中、高劑量組A549細胞的抑制率分別為39.51%、60.85%和88.21%。將上述3組劑量所對應的抑制率連接成線，得出近似直線方程為：Y=aX+b，其中Y為抑制率，X為對應的劑量，a為系數，b為直線在Y軸上的截距。b=23.27，a=81.16。當Y=50時，X=0.334，即125I粒子對A549細胞的IC50值≈0.4 mCi。同理，低、中、高劑量組對2BS細胞的抑制率分別為11.26%、13.14%和23.98%。得出125I粒子對2BS細胞的IC50值≈1.65 mCi。

3 討 論

125I粒子釋放的γ射線破壞腫瘤細胞核的DNA雙鏈，同時產生自由基使腫瘤細胞損傷，持續照射腫瘤細胞，使其氧增比減少、乏氧細胞減少，不斷地消耗腫瘤干細胞而使腫瘤細胞死亡，失去增殖能力[8-9]。對處于DNA合成后期及有絲分裂期階段的腫瘤細胞，少量的γ射線即能破壞其增殖能力；而處于增殖周期中其他階段的腫瘤細胞，對γ射線敏感度較差；靜止期的腫瘤細胞，對γ射線相對不敏感。腫瘤生長過程中只有一小部分細胞在持續增殖，因此分次、短時外照射只能對腫瘤繁殖周期中一部分時相的細胞起治療作用，亞致死損傷的細胞快速修復，不同周期間細胞再分布，存活的活性細胞繼續增殖，直接影響外照射的治療效果[10]。將放射性粒子植入到瘤體和瘤周，低能量、持續照射腫瘤細胞，可使亞致死損傷細胞的修復率顯著降低。因持續的組織間放射不可避免地影響著腫瘤細胞生長的微環境，將放大潛在致死損傷效應。腫瘤細胞處在不同的細胞周期，持續的照射可使較多處在敏感期的細胞被殺滅，使腫瘤細胞大部分遲滯于G2期[11-12]，有效控制腫瘤的再群體化。

本實驗中活度為0.2、0.4和0.8 mCi的125I粒子所輻射的γ射線造成的放射損傷多屬亞致死性損傷和潛在致死性損傷，由于125I粒子置入培養皿，腫瘤細胞受到持續性損傷，得不到自我修復的機會。A549細胞生長曲線顯示：高劑量組125I粒子對A549細胞有明顯的殺傷作用，中劑量組125I粒子對A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用，低劑量組125I粒子對腫瘤細胞增殖抑制不明顯，可能是其活度偏低的緣故。2BS細胞生長曲線顯示：僅高劑量組125I粒子對細胞增殖有一定抑制作用，而低、中劑量組均無明顯抑制細胞增殖作用。本文作者認為：正常組織對125I粒子所輻射的γ射線較為耐受，即要對正常組織產生放射損傷需要更高活度的125I粒子，這也是2BS細胞的IC50值遠高于A549細胞的原因。

本研究結果表明：①體外實驗證實放射性125I粒子的活度為0.4 mCi時已對A549細胞具有明顯的殺傷效應，0.8 mCi時殺傷效應更強。故推薦臨床使用粒子的有效活度范圍是0.4～0.8 mCi。②放射性粒子125I對2BS細胞的IC50為1.6 mCi，臨床應用放射性粒子125I的安全劑量應為0.4～0.8 mCi。

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