脂質體法介導pIRES2-EGFP-hVEGF165轉染人胎盤源間充質干細胞

王博蔚，高 尚，朱振威，劉春麗,朱 鎮，劉志輝

(1.吉林大學第二醫院婦產科，吉林 長春 130041；2.吉林大學口腔醫院口腔修復科，吉林 長春 130021；

3.吉林大學口腔醫院口腔頜面外科，吉林 長春 130021；4.江蘇省鎮江市口腔醫院口腔修復科，江蘇 鎮江 212002)

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是能誘導血管生成、增加血管通透性及維持血管功能的強效促血管形成因子，在創傷愈合過程中發揮重要作用[1-3]，將其運用于難愈性創傷的治療是目前研究的焦點，VEGF家族有5種亞型，其中VEGF165是最為重要的表型。因為VEGF半衰期較短，在正常組織中約為30～45 min，在缺血部位能延長至6～8 h，這就要求有一個緩釋系統以延長VEGF作用于創傷修復部位的時間。近年研究者[4-10]發現：骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪源間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在創傷修復領域具有重要應用潛能，可以向創傷局部擴充歸巢，向創傷修復細胞—內皮細胞及成纖維細胞定向分化或通過創造增強修復的微環境促進組織內源性細胞的再生，從而加速創傷愈合；干細胞同時也是基因治療的良好載體細胞，可以攜帶目的基因到達靶區域發揮治療作用。人胎盤源間充質干細胞(human placenta -derived mesenchymal stem cells，HPMSCs)是近幾年逐漸受到關注的新的成體干細胞來源，本文作者前期研究[11-12]表明：HPMSCs在形態及生物學性狀方面與BMSCs基本一致，在特定誘導條件下可以向內皮細胞定向分化，提示HPMSCs可以作為創傷修復的種子細胞。本研究擬構建VEGF的真核表達質粒pIRES2-EGFP-hVEGF165，并通過脂質體法將其轉入HPMSCs中，探討hVEGF165對HPMSCs增殖的影響及攜帶目的基因的HPMSCs的多向分化潛能，旨在為進一步應用VEGF轉基因干細胞移植方法治療難愈性創傷的研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人白血病細胞 HL-60(吉林大學第二醫院沈維章博士惠贈)，大腸桿菌 DH5α(吉林大學白求恩醫學院生物化學與分子生物學實驗室)。HPMSCs已經本實驗室培養并鑒定,來源于吉林大學第二醫院產科廢棄的胎盤，經產婦同意，通過密度梯度離心法分離培養獲得。HPMSCs屬于成體干細胞，不涉及倫理問題，引物(Cyagen Biosciences),RT-PCR試劑盒、 瓊脂糖,T4噬菌體DNA連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒(Promega)，限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ(Takara)，LB(明海生物制品公司),DNA-Marker、Trizol、 溴化乙錠(EB) 、DEPC和IMDM 培養液(Sigma,USA)，小牛血清(Hyclone)，PBS(北京中山生物技術有限公司)，pMD18 T vector和真核表達質粒 pIRES2-EGFP (Clontech,USA)，Lipofectin脂質體懸液(Gibco)，DEME培養基、ECV304(基礎醫學院生化教研室惠贈)，G418選擇培養基(寶泰克公司)。

1.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165的構建及鑒定

1.2.1 目的基因片段VEGF165的獲得與擴增 HL-60 細胞用含10%小牛血清的 IMDM 完全培養液培養，待細胞生長達瓶底 80%時，收集細胞、計數，用 Trizol 提取 HL-60 細胞的總 RNA，測定RNA的濃度，A260/A280比值在 1.8 時最佳。cDNA 第1 鏈采用Oligo ( dT) 和M-MLV 反轉錄酶，按操作說明合成。PCR 引物設計與合成：從 GenBank 中查找 hVEGF165 的全長基因序列，按照引物設計的基本原則，設計1對上游由啟始密碼子ATG 開始，下游以終止密碼子TGA 結尾的引物，并分別在上、下游引物上添加EcoRⅠ與BamHⅠ 限制性酶切位點序列，送Cyagen Biosciences合成hVEGF165引物序列：上游，5′-CGGAATTCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-TG-3′，含EcoRⅠ 限制性酶切位點；下游,5′-CGGGATCCTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3′，含BamHⅠ 限制性酶切位點。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收和純化。將純化后的hVEGF165 PCR產物連接至克隆載體 pMD18 -T vector。連接產物轉化到感受態細胞DH5α中。觀察菌落生長情況，藍、白斑篩選陽性細菌克隆，培養后進行 PCR 篩選,最后進行重組克隆載體 pMD18-T vector-hVEGF165 的酶切鑒定。

1.2.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165 的構建及鑒定 用EcoRⅠ 、BamHⅠ 雙酶切 pMD18-T-hVEGF165與pIRES2-EGFP，用T4DNA連接酶將上述回收產物進行粘端連接，構建 pIRES2-EGFP-hVEGF165，連接產物轉化感受態細胞 DH5α,pIRES2-EGFP-hVEGF165 的雙酶切鑒定。

1.3 pIRES2-EGFP-hVEGF165轉染HPMSCs

1 mL無血清完全DEME稀釋pIRES2-EGFP-hVEGF165和pIRES2-EGFP，渦旋1 s,加Lipofectin脂質體懸液，再渦旋，室溫放置5～10 min，使二者結合，制備pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin復合物和pIRES2-EGFP-Lipofectin復合物。A組在每個培養孔的培養細胞中加入pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin復合物;B組在每個培養孔的培養細胞中加入pIRES2-EGFP -Lipofectin復合物;C組為對照組(未轉染組，有pIRES2-EGFP-Lipofectin 無 HPMSCs)。將細胞培養于最小致死劑量0.5 g·L-1的G418選擇培養基中，抗性細胞篩選，15 d篩選出陽性細胞克隆，其陽性克隆在0.5 g·L-1的G418維持劑量下繼續擴大培養2周備用。

1.4 HPMSCs轉染pIRES2-EGFP- hVEGF165后VEGF表達活性鑒定

①轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表達VEGF蛋白的Western blotting檢測;②MTT法檢測轉染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs所表達的VEGF的生物學活性:將人內皮細胞株ECV304用2×103孔密度接種于96孔培養板中，并加入1/2體積的各組轉染上清液,加入MTT溶液繼續培養4 h，再加入DMSO液100 μL,震動搖晃，待藍色沉淀充分溶解后，測定各孔A480值。③MTT法檢測轉染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs增殖活性的變化：分別取生長良好的傳代細胞接種于96孔板，每孔加各組細胞懸液200 μL，培養36 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,繼續培養4 h，每孔加入150 μL DMSO。選擇490 nm波長，酶聯免疫檢測儀上測定各孔的A值。④熒光顯微鏡下觀察重組質粒的轉染結果：通過報告基因增強型綠色熒光蛋白(EGFP)觀察目的基因轉染情況。

1.5 鑒定轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs的多向分化潛能

①成脂肪誘導。誘導體系：含10%經篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松1 μmol·L-1、消炎痛200 μmol·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1、胰島素10 mg·L-1，油紅染色鑒定脂滴形成。②成軟骨誘導。誘導體系：含2.5%經篩選FBS的DMEM-HG并加入胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉6.25 mg·L-1、BSA 1.25 mg·L-1、丙酮酸鈉1 mmol·L-1，抗壞血酸磷酸37.5 mg·L-1，TGF-β150 μg·L-1，Alcian blue染色鑒定。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 pIRES2-EGFP-hVEGF165的構建及鑒定

2.1.1目的基因片段的擴增 VEGF165 基因序列全長為 576 bp,取逆轉錄 PCR 產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，在大約 600 bp 處出現有目的條帶，見圖1。

2.1.2 重組克隆載體 pMD18-T-hVEGF165 的雙酶切鑒定 限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組克隆載體電泳結果顯示：在約600 bp 處出現一條帶，與目的片段大小一致。見圖2。

2.1.3 重組表達載體的酶切鑒定 pIRES2-EGFP-hVEGF165重組表達載體經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后電泳結果顯示：重組體中含有與目的片段大小一致的片段。見圖3。

圖1 RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 pMD18-T-hVEGF165重組質粒EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后電泳圖

圖3 EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pIRES2-EGFP-hVEGF165的電泳結果

2.2 pIRES2-EGFP- hVEGF165轉染HPMSCs

2.2.1 G418篩選結果 C組在第5天時細胞已經全部死亡；而A組與B組在篩選的第7天有少數細胞存活，每低倍視野約為1～5個細胞，轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs經G418選擇性培養基篩選，15 d后出現陽性細胞克隆。見圖4。

圖4 轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs

2.2.2 RT-PCR檢測hVEGF165的表達 在凝膠圖像分析系統上可見A組HPMSCs 中hVEGF165的表達較B組強。B組也有與目的片段大小一致的片段表達。見圖5。

2.2.3 轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表達hVEGF165的Westren blotting分析 B組在45 000 bp 處見一表達較弱反應顯色帶，而A組在45 000 bp處顯現單一特異性較強反應顯色帶，為hVEGF165基因表達產物。見圖6。

圖6 Western blotting檢測轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs 中hVEGF165的表達

2.2.4 MTT法檢測轉染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs中VEGF165的生物學活性 A組HPMSCs表達的VEGF165的生物學活性(0.870 0±0.028 5)明顯高于B組(0.690 0±0.087 6)和C組(0.540 0±0.012 4) (P<0.01)，B組高于C組(P<0.05)，組間比較差異均有統計學意義。

2.2.5 轉染hVEGF165的HPMSCs細胞增殖活性的變化 A組HPMSCs增殖活性(0.624±0.019)明顯高于B組(0.426±0.016)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 熒光顯微鏡下重組質粒轉染結果

轉染48 h后，A和B組中均可見大量表達EGFP的細胞;轉染48～72 h后，為綠色熒光表達高峰期;1周后表達開始減弱，至3周時仍可見EGFP的表達。見圖7(插頁三)。

2.4 轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs多向分化潛能的鑒定

在成脂肪誘導環境下誘導2周后，用油紅O染色，可見細胞內產生的脂肪被特異性染成紅色(圖8A，見插頁三)；在成軟骨誘導環境下誘導2周后，將細胞團打散涂片，Alcian blue染色，高倍鏡下可見Ⅱ型膠原形成的細胞外基質被特異性染成藍色(圖8B，見插頁三)。

3 討 論

目前基因治療已成為世界上最活躍的研究領域，幾乎滲透到醫學研究的各個領域。VEGF在促進創傷修復與組織愈合過程中發揮的重要作用已經得到學者的普遍認同，但是由于VEGF單獨應用存在半衰期短、穿透力差、易于吸附細胞外基質、生物利用率低、需反復使用且劑量較大、費用昂貴等不利因素，使其臨床應用受到限制。隨著分子生物學的發展，通過轉基因技術使創面局部組織VEGF165高效、長效表達，可克服直接應用外源性VEGF165的缺點，并利用干細胞作為目的基因的載體，一方面發揮其本身促進創傷的作用，另一方面運送目的基因到達靶區域發揮促愈作用，有望為難愈性創傷的治療開辟新的途徑。本實驗成功構建pIRES2-EGFP-hVEGF165。脂質體介導基因轉染法是目前最常用的方法之一,技術成熟,安全可靠；其中以陽離子脂質體介導的載體系統(質粒) 的應用最為廣泛,其無免疫原性、無毒、無致癌性,易大量制備,轉染效率雖不及病毒載體高,但已通過美國國立衛生研究院(NIH) 和重組DNA 咨詢委員會(RAC) 的批準作為基因治療的載體進入Ⅱ期臨床試驗,用于某些癌癥的治療。因此,從后期動物實驗安全等方面的綜合考慮,本實驗選擇陽離子脂質體介導的pIRES2- EGFP-hVEGF165轉染HPMSCs,使VEGF在細胞內高效、穩定地暫時表達。這既符合創傷修復基因治療的要求,同時又避免病毒載體介導的基因治療有可能存在的潛在缺陷性。轉染48 h后，通過熒光顯微鏡可以觀察到A組及B組中有大量EGFP表達，提示報告基因已成功轉入HPMSCs，說明脂質體介導的pIRES2-EGFP-hVEGF165轉染HPMSCs是可行的。RT-PCR及Western blotting檢測均發現pIRES2-EGFP-hVEGF165轉染的HPMSCs有VEGF強表達，pIRES2-EGFP轉染的HPMSCs也有VEGF的表達，但表達較弱；本實驗結果一方面說明VEGF已成功轉入HPMSCs中，另一方面說明HPMSCs本身具有VEGF的內分泌功能。

本研究中MTT法結果表明：轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs所表達的hVEGF165的生物學活性明顯提高，提示hVEGF165轉染HPMSCs后得到持續高效表達。轉染pIRES2-EGFP的HPMSCs所表達的hVEGF165的生物學活性高于空白對照組，提示HPMSCs本身具有hVEGF165的內分泌功能。轉染pIRES2-EGFP-hVEGF165后HPMSCs的增殖活性明顯增強，說明hVEGF165對HPMSCs的增殖起促進作用。

綜上所述，本實驗成功構建了pIRES2-EGFP- hVEGF165真核表達載體，并運用脂質體轉染法將其成功轉入HPMSCs中，一方面hVEGF165在HPMSCs中有較強表達并被正確修飾，說明HPMSCs可以作為hVEGF165基因治療的載體細胞,轉VEGF基因HPMSCs可以實現hVEGF165的緩釋長效作用；另一方面提示HPMSCs本身也具有內分泌hVEGF165的功能，但作用較弱，hVEGF165對HPMSCs的增殖具有明顯促進作用。本實驗為下一步運用攜帶hVEGF165基因的HPMSCs治療難愈性創傷的研究奠定了實驗基礎。

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