蛋白激酶CK2抑制劑TBB對甲狀腺鱗癌細胞株SW579CK2β和Akt表達的影響

劉 超，劉 洋，趙 頌，王翠瑤，肖建英

(遼寧醫學院生物化學與分子生物學教研室,遼寧 錦州 121001)

蛋白激酶2(CK2)是一種生存性激酶，全酶以異構四聚體形式存在，由2個催化亞基(ɑ或ɑ′)和2個調節亞基(β)構成，作為底物和與其相互作用蛋白的接頭蛋白發揮重要作用。CK2持續激活并普遍存在于腫瘤組織中，因此被認為是藥物治療的潛在靶點[1]。有許多證據支持CK2的抗凋亡作用[2]，其作用機制是多方面的，因為CK2有眾多底物。此外，CK2的許多靶蛋白參與細胞的生存和死亡，CK2和一些其他的生存途徑密切相關，尤其是與PI3K/PDK1/Akt途徑密不可分[3]。Akt，又叫蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是調節細胞死亡、增生、生長和代謝的重要蛋白激酶，是PI3K的重要下游分子，其活性依賴于PDK1 和mTORC2分別對Thr308 和Ser473的磷酸化，只有這2個關鍵性亞基聯合磷酸化才能使Akt完全激活[4-5]。高選擇性膜通透性CK2抑制劑四溴苯三唑(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole，TBB)的應用為認識CK2激酶的特殊細胞功能提供了一個很好的工具。但TBB抗腫瘤的具體機制尚不清楚，尤其TBB對甲狀腺癌的作用機制知之甚少。本研究旨在探討TBB對甲狀腺鱗癌SW579細胞株增殖及CK2β與Akt表達的影響，進而探討TBB的抗癌機制，為TBB的臨床開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TBB、L15培養液( Sigma公司)；RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0試劑盒 (Takara 公司)；CK2β(兔抗人多克隆抗體)、β-actin抗體(兔抗人多克隆抗體)(Santacruz公司)、Akt(兔抗人多克隆抗體)、Phospho-Akt (Ser473) 抗體、Phospho-Akt (Thr308) 抗體(Cell Signaling Technology)，Western細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司)；ECL化學發光試劑盒(Piece Biotechnology公司)；預染蛋白Marker(MBI公司)；CK2活性測定試劑盒(Upstate公司)；[γ-32P]購自北京福瑞生物工程公司； BB16UV CO2培養箱(Heraeus)；Sunrise自動酶標檢測儀(Tecan公司)；PCR擴增儀(Eppendorf公司)；凝膠自動成像儀GDS8000、電泳儀、電泳槽(Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養及實驗分組甲狀腺鱗癌細胞株SW579購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。培養基為L15，含10%的胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1的鏈霉素，在飽和濕度、37℃、無CO2孵箱中培養，當細胞匯合至培養瓶底面積80% 左右時進行傳代培養。當細胞處于對數生長期時，以1×105mL-1濃度接種于25 cm2的培養瓶中或96孔培養板中。24 h后待細胞貼壁后給藥，TBB 組終濃度為25 μmol·L-1，Wortmannin組終濃度為100 nmol·L-1，設空白對照組及DMSO組，DMSO組加入5 μL DMSO [DMSO濃度小于0.1% (V /V)，此濃度對細胞生長無影響]。

1.3 MTT比色法測定細胞增殖抑制率取對數生長期的細胞SW579，胰酶消化，吹打為單細胞懸液，以每孔1×105mL-1細胞接種于96孔培養板中，每孔200 μL，培養細胞24 h后加入25 μmol·L-1TBB和100 nmol·L-1Wortmannin，每組6個復孔，DMSO組加入等體積DMSO，并設空白對照。作用24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1) 20 μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，選擇570 nm波長，酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度(A)值，并計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

1.4 RT-PCR方法檢測CK2β和Akt的mRNA表達水平采用Trizol一步法提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，于核酸蛋白測定儀測定RNA含量，當A260/A280比值達1.9～2.0時可用于逆轉錄反應。用TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒，按操作步驟進行。反轉錄條件42℃、30 min；99℃、5 min；5℃、5 min。PCR引物序列：CK2β，5′-AGCCGAGATGCTTTATGGA-3′,5′- GTGTCTTGATGACTTGGG-TG-3′，229 bp；Akt，5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′,5′- GCCAGGGACACCTCCATCT-C-3′,121 bp；β-actin,5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，5′-CTAGAAGC-ATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，661 bp。循環條件：94℃預變性5 min；94℃、30 s；CK2β基因52.6℃、Akt基因59.3℃、30 s；72℃、50 s；30個循環；72℃終延伸10 min。取PCR產物10 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應用EDAS290凝膠成像分析系統進行灰度測量，基因mRNA表達水平以每一樣品與其內參β-actin灰度比值表示。

1.5 Western blotting方法檢測CK2β、Akt、Akt-pS473和Akt -pT308的蛋白表達收集對照組及處理組細胞，用預冷的PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。每瓶細胞加裂解液80 μL，冰上放置30 min，超聲破碎20 s/次，3～4次。12 000 r·min-1離心20 min取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。取50 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫搖動2 h進行封閉，封閉后的濾膜再分別與CK2β和Akt抗體(稀釋比為1∶500)、Akt-pS473、Akt-pT308(稀釋比為1∶ 200)、β-actin(稀釋比為1∶1 000) 4℃溫育過夜。經TTBS洗滌后，HRP偶聯的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000) 室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發光法顯色。內參采用β-actin。計算機軟件Image J處理，進行密度分析，計算灰度值。

1.6 蛋白激酶CK2活性的測定收集加入上述處理的SW579細胞，用加蛋白酶體抑制劑cocktail的PBS沖洗，超聲裂解，12 000 r·min-1離心5 min，收集上清測蛋白濃度。每個反應取等量的蛋白然后按照Casein Kinase 2 Assay Kit說明書測定CK2的活性。加入10 μL的收集液(20 mmol·L-13-嗎啉基丙磺酸，pH 7.2；25 mmol·L-1甘油磷酸鹽；5 mmol·L-1乙二醇四乙酸酯；1 mmol·L-1正礬酸鈉,1 mmol·L-1二硫蘇糖醇)，加入 10 μL特異性多肽合成底物(RRRDDDSDDD) (終濃度200 μmol·L-1)。10 μL PKA抑制劑500 μmol·L-1ATP及100 mCi·L-1[γ-32P] ATP后開始反應。每1個反應做3個平行管。樣品在30℃水浴反應30 min，然后加入20 μL 40%三氯乙酸終止反應。將樣品滴在Whatman P81 強陽離子交換濾紙上，將濾紙放入0.75% 磷酸溶液中反復沖洗3 次以降低反應背景。再將濾紙放入液閃瓶中，并加入10 mL蒸餾水，然后用 LS3801Beckman 液閃計數分析儀測定cpm值。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖抑制率的變化TBB組細胞增殖抑制率(28.08%±9.743%)與Wortmannin組(24.54%±7.824%)比較差異無統計學意義(P>0.05)；但藥物處理組與對照組(0%)比較差異有統計學意義(P<0.01)，DMSO組(4.101%±2.408%)與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 CK2β和Akt mRNA 表達水平PCR產物瓊脂糖凝膠電泳灰度測量分析表明：對照組CK2β和Akt表達量較高。與對照組比較，TBB組CK2β的mRNA 表達水平顯著降低(P<0.01)，Akt的mRNA 表達水平無明顯變化；Wortmannin組Akt的mRNA 表達水平顯著降低，CK2β的mRNA 表達水平無明顯變化。見表1和圖1。

表1 CK2β和Akt的mRNA表達水平

圖1 SW579細胞中 CK2β(A)和Akt(B)的mRNA表達水平電泳圖

2.3 蛋白激酶CK2的活性與對照組[(5 118.0±126.6) cpm]和DMSO組[(5 024.0±271.7) cpm]比較，TBB組CK2活性[(2 453.0±87.2) cpm]明顯降低(P<0.01)，而Wortmannin組內源性CK2活性[(5 060.0±164.4) cpm]無明顯變化(P>0.05)。

2.4 CK2β、Akt、Akt -pS473和Akt-pT308的蛋白表達水平與對照組比較，Wortmannin組內源性CK2β的表達無明顯變化，TBB組CK2β的表達明顯降低。同時Akt Thr308和Ser473磷酸化狀態受到抑制，總Akt的水平未受處理因素的影響。見表2和圖2。

表2 SW579細胞中CK2β、Akt、Akt -pS473和Akt-pT308蛋白的表達水平

圖2 SW579細胞中CK2β、Akt、Akt-pS473和Akt-pT308蛋白表達的Western blotting檢測結果

3 討 論

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，在人群中的發病率為4%～7%。雖然近幾十年來傳統的治療方式如手術、 放療和化療等有了很大的改進，但由此帶來的嚴重副作用使以上治療方式受到極大限制[6]，因此尋找一種潛在、穩定、 選擇性的抗甲狀腺癌藥物成為當前研究甲狀腺癌治療的熱點。探討CK2多功能性的研究受到限制，是由于其持續活性且抑制細胞內其他激酶的活性等特點，應用比較多的是激酶失活型的突變體和RNAi技術。這些技術由于細胞內CK2蛋白有較長半衰期，細胞內定位和內源性CK2的高表達而受到阻滯[7]。Wang等[7]和 Seeber等[8]報道:RNAi 和反義核酸有時是無效的，需要持續地處理細胞以達到有效敲除CK2的目的。這些局限性使藥理學方法成為最有潛力的工具去研究CK2細胞水平功能，并解釋開發特殊的細胞通透性CK2抑制劑的必要性[8]。TBB為一種膜通透的高選擇性CK2抑制劑，已證明其在鑒定CK2作為細胞內靶點和揭示CK2在腫瘤細胞凋亡過程中發揮重要作用[1,9]。目前TBB在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。

本實驗結果表明：Wortmannin對內源性CK2的活性完全不起作用，TBB顯著地抑制CK2的活性和蛋白表達進而誘導細胞凋亡，而CK2的mRNA水平也下降，說明TBB對CK2在轉錄和翻譯及翻譯后修飾水平都可能存在調節作用。25 μmol·L-1TBB對Akt的mRNA和蛋白水平無影響，但下調CK2的表達,Akt 的Thr308磷酸化狀態明顯降低，盡管其不是CK2的直接作用靶點[10]，這與本實驗中TBB作用于SW579后引起Akt Thr308磷酸化狀態的抑制結果相一致。然而Ser473的磷酸化狀態是否受到影響與細胞內CK2的活性狀態有關系，不同的實驗室報道[11-12]不盡相同，同時也與不同的細胞株和遺傳背景有關。本實驗結果說明Akt活性的下降是由底物水平磷酸化降低引起的。CK2有助于保持Ser473和Thr308的磷酸化水平，是Akt活性調節的重要機制。Di Maira等[10]報道:CK2可直接磷酸化Akt 129位Ser殘基，促使Akt進一步激活。CK2是否通過磷酸化Akt 129位Ser殘基后進一步磷酸化Ser473和Thr308，進而維持Akt的活性狀態，以及TBB對甲狀腺鱗癌SW579細胞株的抑制作用是否通過調控 PI3K/AKT信號通路來實現，還有待進一步研究。

[參考文獻]

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