四碘甲腺乙酸對(duì)耐藥性人胃癌細(xì)胞系體內(nèi)和體外增殖的抑制作用

崔殿龍，解百宜，胡 蒙，向 欣，包傳恩，陳玉強(qiáng)

(1.廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院 解放軍第一七四醫(yī)院腫瘤外科，福建 廈門 361003；

2.廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院 解放軍第一七四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 廈門 361003)

目前已經(jīng)證實(shí)甲狀腺激素(T3及T4)對(duì)乳腺、神經(jīng)膠質(zhì)以及甲狀腺腫瘤細(xì)胞增殖可發(fā)揮促進(jìn)作用。另外，通過對(duì)一種突變型甲狀腺激素核受體的轉(zhuǎn)基因鼠研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素核受體能加速浸潤(rùn)性甲狀腺癌的發(fā)生，與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)[1]。近期臨床證據(jù)表明：甲狀腺功能減退可以影響多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌的生長(zhǎng)[2]。有研究[3-4]證實(shí): 一種脫氨基形式的甲狀腺激素—四碘甲腺乙酸(tetraiodothyroacetic acid，Tetrac)可拮抗多種激素的促增殖效應(yīng)，并通過抑制細(xì)胞增殖和血管形成發(fā)揮抗腫瘤功能。目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤的多種藥物抵抗機(jī)制，包括表達(dá)藥物抵抗泵基因[5]，其產(chǎn)物能插入細(xì)胞膜，將化療藥物運(yùn)出到細(xì)胞外基質(zhì)，而甲狀腺激素可以作用于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[6]等質(zhì)膜運(yùn)輸系統(tǒng)。本文作者研究使用Tetrac抑制阿霉素(doxorubicin,Dox)抵抗性人胃癌細(xì)胞系SGC-7901/R體內(nèi)外增殖的可能性及可能機(jī)制，旨在為耐藥性胃癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑人胃癌細(xì)胞系SGC-7901為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Dox和Tetrac購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，14C標(biāo)記的Dox和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購(gòu)自美國(guó)Amersham公司，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子P糖蛋白(drug transporter P-glycoprotein，P-gp)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST)抗體以及β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。通過腫瘤細(xì)胞與Dox孵育，逐漸增加藥物濃度(從10-9mol·L-1到10-5mol·L-1)，培養(yǎng)6個(gè)月以上即構(gòu)建成功藥物抵抗細(xì)胞系(SGC-7901/R)。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)分為SGC-7901與SGC-7901/R 2組，分別與不同濃度Tetrac(25～125 mg·L-1)以及經(jīng)典抗腫瘤藥物依托泊苷(Etop，10-4mol·L-1)、Dox(10-7mol·L-1)、順鉑(Cisp，10-6mol·L-1)共同培養(yǎng)4 d，或首先使用Tetrac(30 mg·L-1)預(yù)處理，然后分別用上述經(jīng)典抗腫瘤藥物孵育4 d。MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活性，最終結(jié)果以不同藥物濃度下的腫瘤細(xì)胞存活率來表示。

1.3 Western blotting檢測(cè)培養(yǎng)單層細(xì)胞至90%融合，用PBS沖洗后，使用50 mmol·L-1HEPES(pH 7.4)、150 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1NaF、1 mmol·L-1MgCl2、1.5 mmol·L-1EGTA、10%甘油、1%TritonX-100、1 mg·L-1亮抑酶肽和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟裂解細(xì)胞。通過12% SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。使用特異性一抗和二抗標(biāo)記特異性蛋白并通過辣根過氧化物酶及ECL感光膠片顯色。分析Tetrac、Dox單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SGC-7901/R中相關(guān)耐藥基因P-gp、SOD和GST表達(dá)的影響。

1.4 Dox聚集度檢測(cè)Dox抵抗細(xì)胞接種在12孔板中，孵育24 h后加入14C標(biāo)記的Dox(185 Bq)，加或不加入Tetrac(30 mg·L-1)繼續(xù)孵育24 h。用冰冷PBS清洗細(xì)胞3次并裂解。用液閃儀檢測(cè)裂解產(chǎn)物中Dox聚集度。細(xì)胞比例高。

1.5 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-b-Gal)染色細(xì)胞種植在24孔板中，用DMEM培養(yǎng)24 h，Dox、Tetrac單獨(dú)或聯(lián)合加入并培養(yǎng)5 d。常規(guī)β-半乳糖苷酶染色[5]。主要步驟包括：①用3%甲醛孵育5 min 固定細(xì)胞；②沖洗后在37°C與X-gal(1 g·L-1)孵育，使用含40 mmol·L-1檸檬酸(pH 6.5)、5 mmol·L-1氰亞鐵酸鉀、5 mmol·L-1鐵氰化鉀、150 mmol·L-1NaCl和2 mmol·L-1MgCl2的溶液溶解；③24 h后在相差顯微鏡下照相。最終結(jié)果以染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比來表示，陽(yáng)性細(xì)胞比例高說明衰老細(xì)胞比例高。

1.6 凋亡相關(guān)的煙酸已可堿(Hoechst)染色細(xì)胞接種在100 mm培養(yǎng)皿中，Dox、Tetrac單獨(dú)或聯(lián)合加入并培養(yǎng)24 h。使用胰酶在37°C消化3 min。離心獲得細(xì)胞后用4%甲醛固定。PBS沖洗后用0.1 mg·L-1Hoechst 33248孵育，在玻片上顯色并用顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞比例高說明凋亡細(xì)胞比例高。

1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c系裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(5～6周齡，體質(zhì)量30 g左右)。腋部皮下注射SGC-7901/R細(xì)胞(106·100 μL-1)，腫瘤生長(zhǎng)至50 mm3左右時(shí)動(dòng)物被分成4組(n=7)：①生理鹽水對(duì)照組；②Tetrac治療組(30 mg·kg-1)；③Dox治療組(2 mg·kg-1)；④Tetrac(30 mg·kg-1)+Dox(2 mg·kg-1)聯(lián)合藥物治療組。每組小鼠均在第10、13及16天連續(xù)3 d每日1次、共進(jìn)行3次腹腔注射。觀測(cè)小鼠體質(zhì)量,檢測(cè)藥物毒性和致死劑量。每周使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑3次，連續(xù)測(cè)量3周以上。使用公式V=寬度×長(zhǎng)度2/2計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 Tetrac對(duì)SGC-7901和SGC-7901/R細(xì)胞系增殖的抑制作用Dox組SGC-7901細(xì)胞活性隨Dox濃度逐漸增大而明顯減弱，SGC-7901/R細(xì)胞只在極高濃度情況下(>10-6mol·L-1)才開始發(fā)生壞死(圖1A)。在Tetrac干預(yù)組，無論是Dox敏感還是抵抗細(xì)胞系均隨Tetrac濃度升高而壞死明顯加快，在100 mg·L-1時(shí)細(xì)胞全部死亡(圖1B)。

2.2 Tetrac對(duì)經(jīng)典抗腫瘤藥物的增強(qiáng)作用Dox、Etop及Cisp 3種藥物分別聯(lián)合Tetrac作用于SGC-7901/R細(xì)胞系，其抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)明顯增強(qiáng)(P<0.001)。見表1。

圖1 Tetrac對(duì)Dox敏感性和抵抗性腫瘤細(xì)胞增殖的作用

表1 Tetrac對(duì)藥物抵抗的逆轉(zhuǎn)作用

2.3 Tetrac作用下腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性與SGC-7901細(xì)胞比較，P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)子在Dox抵抗的SGC-7901/R細(xì)胞中過表達(dá)，而其他藥物抵抗分子(如SOD和GST)的表達(dá)在2個(gè)細(xì)胞系間并無明顯差別(圖2A);Western blotting結(jié)果表明：Tetrac和Dox單獨(dú)或聯(lián)用均未影響SGC-7901/R中多種藥物抵抗基因P-gp、SOD和GST的表達(dá)(圖2B)。放射性標(biāo)記的Dox檢測(cè)結(jié)果顯示：與單獨(dú)應(yīng)用Dox組 [(623.70±116.45)DPM/106細(xì)胞]比較，Tetrac處理后細(xì)胞內(nèi)Dox的濃度[(1 486.50±39.33)DPM/106細(xì)胞]明顯增高(P<0.001)，表明P-gp的功能可被Tetrac所抑制。

2.4 Tetrac對(duì)藥物抵抗細(xì)胞發(fā)生衰老和凋亡的促進(jìn)作用2個(gè)單獨(dú)用藥組衰老細(xì)胞均很少，而聯(lián)合用藥組處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.001)，表明聯(lián)合用藥組的大部分細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。見表2。

2.5 Tetrac對(duì)藥物抵抗性腫瘤體內(nèi)增殖能力抑制作用Dox的最大耐受劑量是2.5 mg·kg-1，而Tetrac即使應(yīng)用超過60 mg·kg-1也未產(chǎn)生毒副作用。Dox組腫瘤生長(zhǎng)無改變，而Tetrac組腫瘤體積減少70%。聯(lián)合用藥效果并未進(jìn)一步增加，說明在使用濃度上二者不具備明顯的協(xié)同作用。見圖3。

圖2 Tetrac對(duì)經(jīng)典藥物抵抗基因和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)的影響

表2 Tetrac對(duì)藥物抵抗細(xì)胞發(fā)生衰老和凋亡的促進(jìn)作用

圖3 Tetrac對(duì)裸鼠中Dox抵抗性腫瘤增殖的影響

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的明顯特點(diǎn)是有一定適應(yīng)能力，能對(duì)任何類型的壓力產(chǎn)生抗性。從臨床觀點(diǎn)來看，這可能是治療失敗或腫瘤再發(fā)的重要原因。因此，研發(fā)預(yù)防腫瘤產(chǎn)生耐藥性的方法具有很重要的臨床意義。近年來，抗腫瘤藥的品種增加很快，主要集中在抑制多種離子通道方面。這些藥物在體外多有逆轉(zhuǎn)腫瘤藥物抵抗的作用，但在體內(nèi)卻經(jīng)常失去作用，有的還具有高毒性。在研究新型、低毒的藥物抵抗調(diào)節(jié)劑時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)了甲狀腺激素拮抗劑Tetrac[7]。與其他物抵抗逆轉(zhuǎn)性藥物不同，Tetrac無明顯毒副作用，可同時(shí)作用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子和控制藥物敏感性的信號(hào)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞衰老甚至凋亡;這些特點(diǎn)使Tetrac成為一種新型的抗腫瘤藥物[8-10]。

本文作者最初發(fā)現(xiàn):Tetrac在體外抑制藥物敏感性和抵抗性細(xì)胞的效果相當(dāng)，表明這種拮抗劑具有克服藥物抵抗的作用。SGC-7901/R細(xì)胞對(duì)于Dox、Etop和Cisp的敏感性在加入Tetrac后明顯增強(qiáng)。由于SGC-7901/R細(xì)胞對(duì)不同藥物抵抗的機(jī)制不同，Tetrac可能對(duì)多種藥物抵抗途徑均有調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：Tetrac對(duì)細(xì)胞內(nèi)P-gp、SOD和GST表達(dá)無明顯影響，但在加用Tetrac后細(xì)胞內(nèi)聚集的放射性Dox明顯增加，說明Tetrac可抑制P-gp的活性功能。而藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子P-gp的過表達(dá)是抵抗拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(如Dox和Etop)的標(biāo)志，間接證明了體內(nèi)激素平衡調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)化療藥物反應(yīng)性的重要作用，同時(shí)反映了Tetrac在抑制藥物抵抗性腫瘤細(xì)胞方面的潛力。本研究結(jié)果顯示：Tetrac可增強(qiáng)SGC-7901/R細(xì)胞對(duì)Dox、Cisp和Etop的敏感性，但細(xì)胞數(shù)量減少的機(jī)制仍然不明。Tetrac和Dox聯(lián)合處理的SGC-7901/R細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶和煙酸已可堿陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，表明Tetrac可通過強(qiáng)迫腫瘤發(fā)生衰老或凋亡來逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。但對(duì)于大多數(shù)實(shí)體性腫瘤，對(duì)化療藥物敏感導(dǎo)致的細(xì)胞不一定均會(huì)凋亡。最近研究發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老的能力強(qiáng)弱與腫瘤細(xì)胞的結(jié)局相關(guān)，所以很可能Tetrac不僅對(duì)實(shí)體性腫瘤敏感，還可能對(duì)浸潤(rùn)性腫瘤和造血系統(tǒng)腫瘤也比較敏感。結(jié)合本研究在體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)中獲得的明顯效果，且未發(fā)現(xiàn)Tetrac明顯的毒副作用，說明單獨(dú)應(yīng)用Tetrac也具有很強(qiáng)的抑瘤效果。單純聯(lián)用一、兩個(gè)劑量很難決定是否Tetrac與Dox具有協(xié)同作用，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件將有助于明確Tetrac與Dox發(fā)揮協(xié)同抑瘤效果體內(nèi)所需的給藥劑量。

綜上所述，本研究結(jié)果證明：Tetrac具有體內(nèi)和體外抗腫瘤活性。這種甲狀腺激素的類似物可抑制傳統(tǒng)方法抵抗性腫瘤細(xì)胞系的增殖。該藥物除了能夠抑制腫瘤血管生成之外，且無毒性，有望成為治療多種腫瘤的新藥。

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