組蛋白乙酰化酶hMOF在腎透明細胞癌組織中的表達及其臨床意義

遲長亮，蘆志華，管旌旌，王 勇，唐宇哲，蔡 勇，金景姬，王春喜

(1.吉林大學第一醫院泌尿外科，吉林 長春 130021；2.吉林省人民醫院泌尿外科，吉林 長春 130021；

3.吉林大學生命科學學院表觀遺傳學實驗室，吉林 長春 130012)

組蛋白乙酰化修飾在基因轉錄調控、DNA損傷修復及細胞周期調控等生物學過程中發揮重要作用，是近年來表觀遺傳學、腫瘤學領域的研究熱點。組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyl-transferases，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDACs)是調控組蛋白乙酰化修飾的2種重要的酶。組蛋白乙酰化酶hMOF是組蛋白乙酰轉移酶家族的成員之一，負責組蛋白H4的第16位賴氨酸(H4K16)的乙酰化。其表達量的減少將導致整個基因組組蛋白H4K16乙酰化水平的下降，引起基因組的蛋白表達發生改變[1]。目前研究[2]表明：hMOF表達量的異常與惡性腫瘤的發生、發展及惡性程度相關。腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統常見惡性腫瘤之一，其發病機制一直是研究的熱點。目前有關hMOF蛋白與腎癌發病機制的研究國內外尚無相關報道，本文作者通過研究hMOF蛋白在腎癌組織中的表達情況，探討其在腎癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應

1.1.1 標本及主要試劑 收集近期本院行腎癌根治術的癌組織標本9例，其中Fuhrman分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級各3例，并留取癌旁正常腎組織作為對照。主要試劑及儀器：superRT cDNA 試劑盒(CWbio公司)。Tiozol RNA 試劑盒(Biomiga公司)。hMOF及β-actin基因PCR引物，hMOF基因上游引物5′-GAAGTCACGGTGGAGATCGGA-3′，下游引物5′-CTTGGCCAGCAGACACAGGTT-3′；β-actin基因上游引物5′-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGT-3′，下游引物5′-AGCCACACGCAGCTCATT-3′(上海生工生物技術公司合成)。熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7300)。

1.1.2 方法 組織樣本留取后迅速用液氮冷凍保存。采用Tiozol RNA 試劑盒提取組織總RNA，并測定含量。用superRT cDNA 試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，-20℃保存待用。采用SYBER Green嵌合熒光法擴增目的基因和內參基因。qRT-PCR體系如下：SYBR Green 12.5 μL，dH2O 4.5 μL，上、下游引物各2 μL(2 mmol·L-1)，cDNA模板4 μL(2 mg·L-1)。反應條件：預變性，95℃、30 s；PCR擴增，95℃、5 s，64℃、20 s，40個循環；融解曲線分析：95℃、0 s，65℃、15 s，95℃、0 s；退火：60℃。實驗數據應用2-△△Ct進行處理，其前提是目的基因和內參基因擴增率一致[3]。每個樣本重復進行3次實驗，計算各樣本平均Ct(threshold cycle number)值和ΔCt值(ΔCt=Ct目標組-Ct對照組)，計算2-△△Ct,2-△△Ct=2-(△Ct目標組-△Ct對照組)，其數值表示目的基因表達值相對于參照表達值的相對倍數。

1.2 免疫組織化學

1.2.1 一般資料 選取吉林大學第一醫院泌尿外科2007年1月—2010年1月手術切除并經病理證實的RCC標本66例，其中男性43例，女性23例，年齡29～83歲，平均年齡56歲。病理分期采用2002年AJCC腎癌分期系統分為：pT1 18例，pT2 24例，pT3 17例，pT4 7例；組織學分級采用Furhman標準分級：Ⅰ級22例,Ⅱ級22例,Ⅲ級22例，所有患者術前均為原發腎癌，術前均未接受放療、化療或免疫治療。以癌旁正常腎組織作為對照組。所有標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋。

1.2.2 試劑 hMOF蛋白一抗為Bethyl公司生產的hMOF蛋白抗體(編號：IHC-00497)，抗體工作比例均為1∶250。

1.2.3 方法 采用免疫組化染色，將常規石蠟包埋的蠟塊，每例做2 μm連續切片2張，分別行HE染色與免疫組織化學法(LSAB方法)染色。將切片置于有保護膜的載玻片上，常規脫蠟，逐級水化，用0.3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶30 min，微波爐沸騰10 min，再將切片行常規LSAB法染色。用已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結果判定 采用雙盲法，由2位有豐富臨床經驗的病理醫師進行。hMOF以細胞核著色、呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性；根據染色強度與陽性細胞比率雙評半定量法進行評分，A:陽性細胞百分率<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；B：根據切片染色程度進行評分，未染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。最后根據陽性細胞率的得分與染色程度得分相乘作為結果進行判定，0分定為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強陽性()。本實驗中采用免疫組織化學染色評分≤4分和>4分2組進行比較。

1.3 統計學分析

采用SPSS 12.0統計軟件進行統計分析，計數資料和率的比較采用四格表精確概率法和χ2檢驗。

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測結果

9例RCC組織中，4例(44.4%)hMOF mRNA表達水平較其癌旁正常腎組織下降2倍以上(即log2<-1)，其中FuhrmanⅡ級1例，FuhrmanⅢ級3例。RCC組織中hMOF的表達量明顯低于正常腎組織。見圖1。

2.2 免疫組織化學染色結果

RCC組織中hMOF表達量明顯低于正常腎組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。FuhrmanⅢ級中hMOF表達明顯低于FuhrmanⅠ～Ⅱ級，差異具有統計學意義(P<0.05)。中低分化RCC組織hMOF表達明顯低于高分化組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2(插頁四)。

圖1 qRT-PCR分析結果

2.3 hMOF蛋白表達水平與RCC患者臨床特征的關系

根據RCC組織中hMOF蛋白表達水平的綜合免疫組織化學評分，將患者分為hMOF綜合免疫組織化學評分≤4分和>4分2組。比較2組間臨床資料的特點，不同年齡及性別的患者腎癌組織中hMOF蛋白表達量相差不大，差異無統計學意義(P>0.05)。hMOF蛋白隨腎癌組織Fuhrman 分級及病理分期的增高表達量下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時，hMOF蛋白表達水平降低的腎癌患者其區域淋巴結及遠處器官轉移的風險增高。見表1。

表1 hMOF蛋白表達與腎癌患者臨床病理特征的關系

3 討 論

基因有序的轉錄調控是機體細胞維持正常功能的前提，如果基因轉錄調控功能紊亂，細胞可能發生癌變。遺傳調控和表觀遺傳調控共同控制真核基因的表達。隨著人們對疾病認識的進一步加深，表觀遺傳疾病越來越受到重視。表觀遺傳是指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化，即基因型未發生變化而表型卻發生了改變[4]。表觀遺傳調控主要包括DNA甲基化、RNA干涉、組蛋白修飾等方面，其中組蛋白修飾引起的染色體局部構象的改變，在真核生物基因表達調控中發揮著重要的作用。組蛋白修飾主要包括對組蛋白尾部的賴氨酸和精氨酸殘基的乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。其中組蛋白的乙酰化修飾較為普遍。組蛋白乙酰化修飾直接影響核小體的結構，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結合位點[5]。如果組蛋白乙酰化修飾出現了問題，基因組的蛋白表達將發生問題，從而導致癌癥的發生。調控組蛋白乙酰化和去乙酰化的是一對功能相互拮抗的酶—HATs和HDACs。HATs主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙酰基，而HDACs則相反。兩者之間的動態平衡調控基因表達的穩定[6]。任何一方的功能失調，都將導致人類疾病甚至惡性腫瘤的發生。乙酰化酶的突變可引起正常基因不能表達使抑癌基因或調節細胞周期的蛋白出現異常，導致癌癥發生。去乙酰化酶突變或一些和去乙酰化酶相關蛋白的突變使去乙酰化酶錯誤募集而引發腫瘤等疾病[7]。

HATs可歸于兩大類：一類是GNAT家族，另一類是MYST家族。hMOF是MYST HATs家族的成員,又稱MYST1。MYST HATs家族是近年來發現的一個在細胞核內廣泛存在、并有著重要生物學功能的HATs 家族[8]。MYST家族對于維持細胞的正常生理活動具有十分重要的作用。hMOF蛋白最基本的功能是乙酰化組蛋白H4第16位賴氨酸，進而產生一系列的生物學作用。60%的組蛋白H4呈單乙酰化狀態，并且多數發生在組蛋白N端第16位賴氨酸(K16)[9]，即H4K16Ac。體外和體內實驗[10]表明：hMOF介導的組蛋白H4K16乙酰化活性是染色體模板正確轉錄所必需的。大量的研究結果表明：惡性腫瘤的發生、發展與癌基因、抑癌基因異常密切相關，組蛋白乙酰化修飾直接影響癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。所以組蛋白乙酰化修飾的研究有助于進一步明確惡性腫瘤的發生、發展機制。目前的研究[11]結果顯示：hMOF蛋白表達異常可能導致乳腺癌、成神經管細胞瘤等惡性腫瘤的發生，并提示其有可能成為腫瘤術后輔助治療的關鍵生物學指標。本研究結果顯示：hMOF蛋白的mRNA表達量在癌組織中明顯降低，與Pfister等[11]研究的原發性乳腺癌和成神經管細胞瘤的結果具有相同的趨勢，提示hMOF蛋白在腎癌組織表達降低發生在轉錄水平。目前尚無關于hMOF蛋白轉錄水平降低原因的報道，有待于進一步研究，可以從DNA轉錄的起始部位即啟動子的角度進行研究來揭示導致hMOF蛋白表達量降低的原因及其與癌癥發生、發展的關系。

本研究中hMOF蛋白在腎癌組織中表達免疫組織化學評分≤4分為62.1%(39/66),而hMOF蛋白在癌旁組織中表達免疫組織化學評分≤4分僅為6.1%(4/66)，提示hMOF表達的降低是引起RCC發生的一個重要因素；另外中低分化RCC組織中hMOF表達量明顯低于高分化組，提示hMOF表達的高低與腫瘤惡性程度呈負相關，即腫瘤的惡性程度越高，hMOF的表達量越低。揭示hMOF表達量的降低可促使腫瘤的進一步發展。此外，由于RCC根治術后局部復發率僅為1%～2%[12]，本研究66例RCC患者僅有6例出現了腎門淋巴結轉移或遠處器官的轉移，鑒于病例數量較少，隨訪時間較短，目前尚無法通過多變量回歸分析來確定hMOF蛋白作為分子標志物判斷腎癌患者預后的有效性。隨著病例數量的增加、隨訪時間的延長，這一問題將會得到進一步明確。

綜上所述，hMOF蛋白表達異常與腎癌發生、發展有關，可能作為判定腎癌惡性程度的一項客觀指標，對腎癌的診斷及預后判斷具有重要意義。

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