喉鱗狀細胞癌組織中Snail和E-cadherin的表達及其意義

尚 靜，房 寧，滕思瑩，崔香艷，汪 欣

(吉林大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林 長春 130021)

腫瘤轉移表現為細胞脫落、細胞遷移、降解細胞外基質、新生血管形成等級聯反應，而上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表現出的細胞學機制，即細胞黏附的喪失和遷移力的獲得作為腫瘤轉移級聯反應的起始環節越來越受到學者們的重視。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏附素中的一個重要成員，其下調常標志著EMT的發生。E-cadherin介導同型細胞間的連接，維持正常上皮細胞的形態、細胞的極性以及組織結構的完整性[1]。當上皮細胞E-cadherin的表達下調，細胞間的黏附性下降，細胞就從原發部位脫落，若此過程發生在上皮性腫瘤中就可能成為腫瘤轉移的第一步[2]。轉錄因子Snail通過與E-cadherin啟動子區E-box盒結合來抑制E-cadherin的轉錄[3]，降低E-cadherin蛋白水平，促進細胞從相鄰細胞脫落并遷移。Snail高表達于乳腺癌[4]、胃癌[5]、結腸癌[6]、肝癌[7]、食管癌[8]等組織中，并與乳腺癌、胃癌、食管癌組織學分級、淋巴結轉移及遠處轉移密切相關[4-5,8]。然而Snail在喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)組織中的表達國內未見報道，國外也少有研究。本研究旨在分析LSCC組織中Snail和E-cadherin的表達與淋巴結轉移、組織分化的關系，探討EMT與LSCC轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集吉林大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科2008年3月-2009年11月手術切除經病理證實為鱗狀細胞癌的LSCC組織46例，相應手術切除范圍外經病理證實為正常鱗狀上皮的癌旁組織46例。所有患者術前未進行化療和放療。46例喉癌標本中男性32例，女性14例；年齡38～80歲，平均年齡58.62歲(年齡≤59歲25例，年齡>59歲21例)；發病部位：聲門上型30例，聲門型16例；按國際抗癌協會(UICC)的TNM分類標準(2002)分別為T1-T224例，T3-T422例；臨床分期Ⅰ-Ⅱ期12例，Ⅲ-Ⅳ期34例；有頸淋巴結轉移26例，無頸淋巴結轉移20例；按組織學分級：高分化13例，中分化20例，低分化13例。

1.2 主要試劑及步驟小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(MAB-0589)(即用型)，超敏S-P免疫組化試劑盒(KZT9710)，小鼠抗人Snail單克隆抗體(bs-1371R)。石蠟切片脫蠟、水化、修復后，滴加一抗(小鼠抗人Snail單克隆抗體稀釋度為1∶100，小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體稀釋度為1∶200)，4℃過夜，以PBS代替一抗作為陰性對照。滴加二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈酶親和素-生物素-辣根過氧化物酶，DAB顯色和蘇木精復染色，脫水和透明后用中性樹膠封片。

1.3 結果判斷Snail及E-cadherin表達的免疫組化結果判定方法：每張切片在100倍視野找到表達密集區，200倍下計數3個視野、200個細胞。染色結果綜合染色強度及陽性細胞數進行分析，染色強度積分分值(IRS)=SI×PP，SI表示染色強度，無染色為0分，弱染色為1，中等染色為2，強染色為3；PP是陽性細胞百分比，陽性率0記為0分，<10% 為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。按照積分分值分為：陰性(—)，0～1分；弱陽性(+)，2～3分；中度陽性()，4～6分；強陽性()，>6分。弱陽性、中度陽性及強陽性表達合稱為陽性表達。

1.4 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，Snail和E-cadherin在LSCC、癌旁組織中表達陽性率比較，以及兩者在LSCC中的表達與臨床病理因素間的關系，均采用χ2檢驗；Snail和E-cadherin在LSCC中表達的相關性采用Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 Snail在LSCC和癌旁組織中的表達Snail表達可見于細胞漿或細胞核，陽性細胞為棕黃色顆粒彌漫分布于細胞漿或棕褐色顆粒分布于細胞核內。在LSCC組織中，Snail表達多為陽性或強陽性，多數位于細胞核內(圖1A～C，見插頁四)；在癌旁組織中，Snail表達主要為陰性和弱陽性，陽性多位于細胞漿區域，少數細胞核染成棕褐色(圖1D，見插頁四)。LSCC和癌旁組織中Snail表達的陽性率分別為69.57%(32/46)和36.96%(17/46)。Snail在LSCC與癌旁組織表達陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=9.824 4，P<0.01)。

2.2 Snail的表達與LSCC臨床病理特征的關系在不同年齡組、不同性別組、不同發病部位組、不同T分級組以及不同臨床分期組Snail表達陽性率的差異均無統計學意義(P>0.05)。而在LSCC的不同組織分化程度組、有無頸淋巴結轉移組比較，Snail表達陽性率的差異有統計學意義(P<0.05)。在不同組織分化組中，Snail的表達程度隨組織分化程度的降低而逐漸增強，且其表達部位由以細胞質染色為主到以細胞核染色為主(圖1A～C，見插頁四)，Snail在高分化、中分化、低分化組中的陽性率分別為46.15%、64.71%和93.75%，低分化組Snail表達陽性率與高分化組、中分化組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而高分化組與中分化組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 E-cadherin在LSCC和癌旁組織中的表達E-cadherin表達的陽性細胞為棕黃色顆粒沿細胞膜彌漫分布或細胞質內見棕黃色顆粒。在LSCC組織中，E-cadherin表達多為陰性和弱陽性，陽性多位于細胞膜區域，少數細胞質染色，但棕黃色顆粒分布不均勻(圖2A～C，見封三)。在癌旁組織中，E-cadherin表達多為陽性或強陽性，多數均勻分布于細胞膜，少數可見細胞質染色(圖2D，見封三)。LSCC和癌旁組織中E-cadherin表達陽性率分別為47.83%(22/46)和78.26%(36/46)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=9.144 0，P<0.01)。

2.4 E-cadherin的表達與LSCC臨床病理特征的關系在不同年齡組、不同性別組和不同發病部位組E-cadherin表達陽性率的差異均無統計學意義(P>0.05)。而在LSCC的不同T分級組、不同組織分化程度組、不同臨床分期組、有無頸淋巴結轉移組比較，E-cadherin表達陽性率的差異有統計學意義(P<0.05)。在不同組織分化組中，E-cadherin的表達程度隨組織分化程度的降低而逐漸降低，表達部位由以細胞膜染色為主到以細胞質染色為主，在低分化組織中大部分組織未見染色，只見少部分細胞漿染色(圖2A～C，見封三)，E-cadherin在高、中、低組織分化組中的陽性率分別為69.23%、58.82%和18.75%，低分化組E-cadherin表達陽性率與高分化組、中分化組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而中分化組與低分化組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 Snail和E-cadherin的表達與LSCC臨床病理特征的關系

2.5 Snail和E-cadherin在LSCC組織中表達的相關性經Spearman等級相關分析，Snail的陽性表達增高，E-cadherin的陽性表達明顯減弱，兩者在LSCC中的表達呈負相關(r=-0.569 0，P<0.01)。

3 討 論

正常上皮依靠細胞間的黏附作用來建立和維持組織細胞的正常形態和功能，如果這種黏附作用出現異常，將會導致細胞的堆積、去分化，甚至侵襲和轉移，形成惡性腫瘤。鈣黏蛋白是細胞黏附分子中的一個家族，其中E-cadherin在維持正常上皮細胞形態、細胞極性及在組織結構完整性中發揮著重要作用[1]。有研究[9]發現：在轉移潛能低、分化較好的細胞如正常上皮細胞MDCK、上皮性腫瘤細胞A431、MCF27、MDA2MB453中均存在較強的E-cadherin mRNA與蛋白的表達;而在轉移潛能高的成纖維細胞3T3、低分化的上皮性癌細胞HepG2、MDA-MB435s、MDA-MB231中，E-cadherin的mRNA與蛋白幾乎檢測不到。本研究結果顯示：在低分化LSCC組織中E-cadherin的表達幾乎為陰性，只在少許細胞的細胞質中見弱表達，未見細胞膜表達，這可能是因為此時的E-cadherin蛋白雖有合成，但不能與細胞膜結合發揮其應有的黏附功能，使細胞黏附力下降，再次支持了EMT通過降低E-cadherin的方式促進惡性腫瘤的轉化和浸潤。Snail屬于轉錄抑制子中的Snail家族，在EMT的細胞信號轉導通路中居于中心環節。研究[10]表明：Snail不僅調控E-cadherin蛋白，還轉錄調控多種在EMT中發揮作用的蛋白，從而被認為是一種重要的腫瘤轉移調節因子。體外實驗將反義Snail轉染入卵巢癌細胞HO9810[10]、肝癌HepG2[11]和鼻咽癌5-8F細胞[12]，可以顯著降低上述癌細胞的運動能力，同時其侵襲細胞外基質的能力也明顯下降，從而明顯降低癌細胞的轉移和增殖。

臨床多項研究表明:Snail和E-cadherin在很多上皮性癌(包括鱗癌、肝癌、黑色素瘤等)中存在明顯的反向表達。在這些研究中還發現侵襲力強的E-cadherin陰性克隆細胞呈現Snail的高表達，而侵襲力弱的E-cadherin陽性克隆細胞幾乎檢測不到Snail的表達。研究[13]發現：在卵巢癌早期Snail在細胞質和細胞核中均表達，而在腫瘤晚期和轉移階段Snail單獨定位于細胞核，此外Snail的表達水平和細胞定位與E-cadherin的表達呈負相關。在本研究中，Snail在高分化LSCC組織中細胞核染色較少，以細胞質染色為主，但在中分化LSCC組織中細胞核染色逐漸增多，但染色程度較低分化組織弱，而在低分化LSCC組織中則以細胞核的強染色為主。而E-cadherin的表達則與Snail相反。說明在LSCC組織中Snail和E-cadherin存在反向表達。

Snail的表達強度與組織分化程度和淋巴結轉移相關，E-cadherin的表達程度除與組織分化程度和淋巴結轉移相關外，還與腫瘤TNM分級和臨床分期相關，考慮可能是在LSCC組織中E-cadherin除受到Snail的調控外，還可能受到其他因子的調控。研究[14]發現：無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，轉錄抑制因子Snail、Slug、SIP1和Twist在梭狀細胞癌中的表達均高于鱗狀細胞癌，Slug、Twist和SIP1的增高具有統計學意義，而Snail無統計學意義。綜上所述，Snail表達越強、E-cadherin表達越弱，LSCC就越有可能發生淋巴結轉移、分化程度越差。因此Snail和E-cadherin聯合檢測可作為判斷LSCC惡性程度和預后的參考指標，并能為個性化治療提供參考信息。

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