HSP70在喉乳頭狀瘤和聲帶白斑組織中的表達及其臨床意義

楊田田,傅仲鷹,王 蘋,楊立新

(吉林大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林 長春130021)

熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是細胞受應激原刺激后誘導所產生的一種最為常見的應激蛋白，被認為是保護真核細胞免受損害的最重要的蛋白。近來研究發現:HSP70高表達與腫瘤密切相關，在正常組織中多不表達，但在多種腫瘤中有不同程度的表達,如乳腺癌中有高表達[1],其高表達可能與腫瘤的發生、發展和預后有關。目前研究表明：HSP70在包括頭頸部鱗狀細胞癌在內的多種腫瘤組織都有異常表達,如在喉癌中表達[2]已有報道，但大多數報道與腫瘤的治療、預后有關，而針對HSP70在喉乳頭狀瘤和聲帶白斑組織中的表達對喉癌的早期防治方面的相關報道較少。本文作者擬通過檢測HSP70及其上游調控因子HSF1在喉乳頭狀瘤和聲帶白斑中的表達,探討HSP70與喉癌發生的關系，進一步揭示HSP70在喉癌發生、發展中的作用，為喉癌的早期診斷和防治提供一種新的途徑。

1 資料與方法

1.1 主要試劑兔抗HSP70抗體和HSF1抗體購于北京博奧森公司，SP試劑盒購于福建邁新公司，其他化學試劑購于北京化工廠。

1.2 標本來源和臨床資料標本來源于2008年1月—2011年6月在吉林大學第一醫院接受手術的7例聲帶息肉、6例喉乳頭狀瘤和6例聲帶白斑,所有病例臨床資料完整，年齡29～59歲，平均35.1歲。以聲帶息肉為對照組。

1.3 免疫組織化學染色將取下的新鮮組織塊迅速置入10%中性甲醛中固定24 h，PBS洗滌3次，常規脫水透明，石蠟包埋，制成厚度為3 μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化。采用SP染色方法，具體如下：切片加入3%過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS洗滌5 min，去除內源性過氧化物酶的活性。然后將切片置于96℃、 0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，孵育10 min進行抗原修復。PBS洗滌，滴加正常山羊血清室溫孵育10 min，然后滴加濃度為1∶100兔抗人HSP70或HSF1多克隆抗體，4℃過夜。PBS緩沖液洗5 min×3，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min。PBS緩沖液洗，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。用PBS緩沖液代替一抗作為標本染色的陰性對照。

1.4 蛋白表達半定量分析切片于低倍鏡和高倍鏡下觀察，每張免疫組織化學染色切片隨機選取5個高倍視野，Leica顯微鏡拍照，免疫組織化學半定量分析綜合評分采用H-score法[3]。①根據染色強度進行評分：淡棕黃色為1分，深棕黃色為3分，介于兩者之間為2分。②根據陽性細胞百分數進行評分：10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色檢測HSP70在喉組織中的表達HSP70陽性表達為棕黃色顆粒，定位于細胞漿和細胞核。在聲帶息肉中低水平表達，HSP70表達主要定位于細胞核。在喉乳頭狀瘤、聲帶白斑表達較強，見圖1(封三)。H-score法半定量結果表明：喉乳頭狀瘤組HSP70表達(4.25±0.53)與聲帶息肉組(3.63±0.58)比較明顯增高(P<0.05)，聲帶白斑組HSP70表達最強(5.43±0.40)，與聲帶息肉組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 免疫組織化學染色檢測HSF1在喉組織中的表達HSF1陽性表達為棕黃色顆粒，大部分定位于細胞漿，少量細胞核。其表達趨勢與HSP70表達趨勢相似，見圖2(封三)。H-score法半定量結果顯示：乳頭狀瘤組HSF1表達(3.80±0.42)與聲帶息肉組(3.17±0.47)比較明顯增高(P<0.05)，聲帶白斑中HSF1表達最強(4.52±0.48)，與聲帶息肉組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 HSP70和HSF1在喉組織中表達的相關性對聲帶息肉、喉乳頭狀瘤和聲帶白斑組織中HSP70蛋白表達量與HSF1表達的關系進行直線回歸分析，結果顯示：HSP70蛋白表達量與HSF1的變化呈現正的直線相關(r=0.867，P<0.01)，即隨著HSP70蛋白表達量的增加，HSF1表達亦增加，二者正相關。見圖3。

3 討 論

HSP70是所有原核和真核細胞在高溫或應激情況下產生的一組非常保守的蛋白質分子,作為分子伴侶可以控制蛋白質的質量或與許多重要的調節因子相互作用調節細胞的增殖、生存和死亡[4]。研究表明：腫瘤形成期間有大量的HSP70表達，高表達的HSP70可調節腫瘤的增殖。李全香等[5]研究發現：HSP70在正常宮頸上皮、CIN及宮頸癌組織中的表達逐漸增高。Kaur等[6]比較正常口腔上皮細胞、異型性細胞及鱗癌細胞,觀察到三者的HSP70表達順次明顯增強,說明癌變后細胞內HSP70的合成增加。其機制可能為HSP70是正常細胞周期中CDC2-CyclinB復合體和CDC2激酶活性所必需的蛋白，高表達的HSP70促進腫瘤細胞的有絲分裂。有學者[7]用HSP70反義核酸轉染胃癌細胞系SCG-7901后可以觀察到，細胞在G1期和S期數量減少，提示下調HSP70表達能夠抑制細胞的生長。本實驗結果表明：喉乳頭狀瘤和聲帶白斑黏膜組織中HSP70的表達明顯高于聲帶息肉，聲帶白斑中的表達最高。因此推測聲帶白斑的發生可能與其高表達的HSP70有關，HSP70可能通過影響細胞周期，導致腫瘤細胞異常增殖，促進喉癌前病變細胞的惡性轉化。

圖3 喉組織中HSP70與HSF1表達的直線回歸分析圖

HSF1是腫瘤發生的一個有力的調節因子，促進腫瘤細胞的惡性轉化。研究[8-9]表明：散發性消化道癌，如胃腸癌及乳腺癌等腫瘤中均發現HSF1的高表達。Hoang等[10]報道：人前列腺癌的發生與HSF1相關，HSF1在轉移型前列腺癌細胞系中呈過表達，且其表達水平與前列腺癌的惡性程度呈正相關，惡性程度越高,HSF1和HSP表達水平越高。HSF1作為調控真核生物熱休克反應的轉錄細胞因子，主要通過誘導HSPs的表達，參與細胞的增殖和生長。Meng等[11]采用RNAi技術沉默HSF1基因，發現下調的HSF1能夠抑制乳腺癌細胞系MCF-10A在裸鼠體內移植瘤的形成和生長，認為HSF1通過HSPs調控腫瘤生成。HSF1基因敲除后，HSP72和HSP27表達下降，p21基因表達增加，同時下調與細胞增殖關系密切的survivin基因，導致腫瘤細胞生長阻滯和細胞老化。Rossi 等[12]在宮頸癌的研究中發現：HSF1基因沉默，直接抑制HSP70 等熱激蛋白的表達，導致大量的腫瘤細胞凋亡，從而使宮頸癌得到控制。Wang等[8]發現：HSF1通過抑制XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)基因表達參與胃癌的發生和發展。HSF1 還在p53 的核轉運過程中有重要作用，因此HSF1也可能通過調節p53活性影響腫瘤的發生[13]。

本實驗結果顯示：HSF1蛋白在聲帶息肉、喉乳頭狀瘤和聲帶白斑中的表達與HSP70趨勢基本相似，同樣在聲帶白斑中高表達；半定量結果顯示：HSP70和HSF1表達強弱程度呈現一致性；相關性分析發現:HSP70蛋白表達與HSF1的變化呈現正的直線相關。提示在喉組織中HSF1主要通過誘導HSP70過表達參與喉癌的發生。本文作者推測高表達的HSF1激活HSP70參與喉癌早期的形成，HSF1和HSP70有望成為判斷喉癌發生的指標。

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