幾種常見腸道致病菌多重PCR檢測的效果評價

劉金華，史艷宇，馬路遙，魏春艷，邵麗筠，王海龍

(1.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062；2.吉林省產品質量監督檢驗院，吉林 長春 130022；3.吉林大學藥學院生物醫學工程教研室，吉林 長春 130021；4.內蒙古自治區錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗公安局，內蒙古 烏里雅斯太 026300；5.吉林大學再生醫學科學研究所，吉林 長春 130021)

近年來全球有關食品安全的惡性事件頻發，食源性致病菌成為威脅食品安全的主要元兇。其中金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌(傷寒沙門菌、腸炎沙門菌)、產氣莢膜梭菌及變形桿菌等引起的食源性疾病居于世界前列[1]。傳統的致病菌檢測均采用生理生化、血清型水平的方法，試驗周期長，耗時費力，且靈敏度受限，因此有必要建立一種快速、簡便、靈敏度高的檢測手段[2-3]。多重PCR檢測方法因其能夠一次對多種致病菌同時檢測，而成為研究熱點[4-6]。本研究擬建立一種多重PCR檢測方法能夠同時檢測出單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、副溶血性弧菌及普通變形桿菌4種腸道致病菌，旨在為臨床疾病診斷、食品安全檢測、流行病學調控等工作提供良好的有效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及其來源

副溶血性弧菌(Vibiroparahaemolyticus，ATCC17802)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris，ATCC33420)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，ATCC11778)購于北京蘭博瑞公司。單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，ATCC19111)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi，ATCC13311)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(分離株)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，ATCC13076)、志賀氏菌(Shigella)(分離株)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，ATCC33291)及大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157) 保存于吉林出入境檢驗檢疫局微生物檢測實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

DNA 提取試劑盒(Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit、PCR 試劑(TransStart Taq DNA Polymerase 及100 bp DNA Ladder Marker)均為北京全式金生物有限公司產品；營養瓊脂(nutrient agar，NA)培養基、胰酪胨大豆瓊脂培養基(tryptose soya agar，TSA) 血平板、溶菌肉湯(luria-bertani，LB) 液體培養基和革蘭陰性增菌液均為北京陸橋技術有限責任公司成品配制。

恒溫培養箱(德國Binder公司)、恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)，離心機3K30型(德國Sigma公司)、梯度PCR 儀ProS型(德國Eppendorf公司)、PowerPac Universal 164-5070 電泳儀(美國伯樂公司)、EC紫外成像系統(美國Alpha公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養 大腸桿菌O157、變形桿菌用營養瓊脂培養基37℃過夜培養，然后挑取2～4個菌落接種到LB 液體培養基，在培養箱經過37℃培養24 h。單核細胞增生李斯特菌用TSA 血平板37℃過夜培養，取2～4個菌落接種到LB液體培養基，37℃培養24 h。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養24 h，然后挑取2～4個菌落接種到氯化鈉結晶紫增菌液，37℃增菌8～16 h。

1.3.2 DNA 的提取 細菌DNA 的提取按照Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit使用說明中的操作規程進行提取。

1.3.3 引物的設計和合成 根據GenBank中上述4種細菌的基因序列，通過序列比對，篩選出4種微生物的特異基因作為靶序列，并根據靶序列設計相應的引物。引物的設計使用Primer express 2.0軟件進行。使用 BLAST 程序，通過 GenBank，對各引物及擴增產物同源性進行比對，以保證引物與靶基因結合的高度特異性。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。序列見表1。

1.3.4 單重PCR擴增 先對上述4種細菌進行單獨擴增，反應體系:模板DNA 1 μL(20 ng·L-1)，上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，10×TransStart Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補足 總體積至25 μL。PCR 擴增條件:95℃預變性3 min；95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，34個循環；72℃ 延伸10 min。

1.3.5 多重PCR擴增體系的建立及退火溫度的優化 多重PCR的反應體系為50 μL 反應體系，其中10×buffer 5 μL，Taq酶1.0 μL、dNTP 7.0 μL、Mg2+0.3 μL、上下游引物分別為1.0 μL時，模板：各加3 μL，ddH2O補足到50 μL。多重 PCR 擴增條件:95℃預變性3 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環；72℃延伸10 min。其中退火溫度分別為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，根據電泳條帶的亮度確定出最佳退火溫度。

表1 多重PCR引物

1.3.6 多重PCR反應的特異性和靈敏性檢測 多重PCR特異性檢測:分別提取志賀菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、產氣莢膜梭菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌O157的基因組DNA，加入同一反應體系，同時加入本研究中的4種細菌對應的特異性引物進行多重 PCR 擴增，以檢測多重 PCR 的特異性。多重PCR靈敏性檢測：4種菌經過37℃培養24 h后，取菌懸液依次10倍進行梯度稀釋，然后按照1.3.2 的方法提取DNA，按照優化后的多重PCR體系進行反應；同時，取稀釋后的各濃度菌懸液各1 mL，涂在LA平面培養板上進行培養，進行菌落計數。多重PCR反應能夠檢出的最小DNA量所對應的菌濃度即為該體系的靈敏度。

1.3.7 模擬果汁中細菌的檢測 購買市售的多種不同品牌果汁，取經普通生化培養鑒定大腸桿菌O157、副溶血性弧菌、普通變形桿菌及單核細胞增生李斯特菌均為陰性的果汁作為添加的樣品。取各稀釋的菌懸液隨機混合，加入到陰性果汁中混勻作為模擬樣本。過夜培養，取模擬樣本各1 mL離心后取沉淀物，按1.3.2試劑盒提取核酸，進行多重PCR檢測。

2 結 果

2.1 單重PCR反應的結果

對于變形桿菌ureR基因的引物進行PCR，擴增出大小約為522 bp 的特異性片段；用編碼單核細胞增生李斯特菌hlyA基因的引物進行 PCR，擴增出大小約為 155 bp 的特異性片段；用編碼大腸桿菌O157的hlyA基因的引物進行 PCR，擴增出大小約為 366 bp 的特異性片段；用編碼副溶血弧菌氨基酸脫氫酶基因引物進行 PCR，擴增出大小約為199 bp的特異性片段。

2.2 多重PCR反應退火溫度的優化

用梯度PCR儀依次設定退火溫度為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，PCR產物的電泳結果顯示：64℃對應的條帶最亮也最清晰，說明64℃為最佳退火溫度。見圖1。

圖1 多重PCR梯度退火溫度電泳圖

2.3 多重PCR特異性的檢測結果

同時在一個反應體系中加入10種菌，然后加入本次研究的單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、變形桿菌和副溶血弧菌相應的特異性引物。結果表明：只有該4種菌擴增出特異性條帶，其他菌PCR結果均為陰性。

2.4 多重PCR靈敏度的檢測結果

對菌液進行梯度稀釋，然后進行多重PCR。結果顯示：第2條泳帶即稀釋成107倍時能夠清晰辨別出4條細菌的特異性條帶，所對應的4種細菌的菌落計數數量級為103CFU·mL-1，即本研究中的4重PCR反應體系的靈敏度。見圖2。

2.5 應用該多重PCR體系檢測人工染菌果汁

對模擬果汁樣品的多重PCR檢測結果表明:該多重PCR體系可以成功擴增出相應的目的基因片段，從而識別出隨機接種的任意3種菌。見圖3。

圖2 多重PCR靈敏度的檢測結果

圖3 多重PCR檢測果汁中的細菌

3 討 論

多重PCR反應是在同一個反應體系中加入幾種目的基因的引物，通過一次反應實現對多種目的基因的同時擴增[7]。由于在一個體系中不同的基因組之間、不同引物之間均會存在相互影響，所以必須對多重PCR體系進行重新優化，主要包括反應中各組分的濃度[8-10]及退火溫度[8-11]。本實驗通過正交設計的方法快速、準確地確定了最合適的各組分濃度，并對退火溫度進行了摸索。本實驗借助梯度PCR儀，一次性快速確定了最佳的退火溫度。此外PCR反應產物的特異性取決于引物和模板的匹配程度，本研究中一次性加入多種不同菌的引物，分別擴增出相應菌的基因片段，實現了一次PCR同時檢測不同病原菌的目的。本實驗對靈敏度的檢測結果與徐曉可等[12]人的多重PCR靈敏度的檢測結果相近，高于李盛豐等[13]多重PCR靈敏度檢測結果?？赡苁怯捎谑褂迷噭┑臄U增效果有差異；所選的菌種不同，彼此之間的抑制作用強弱亦不同；體系中各組分的比例、反應循環數均對多重PCR的擴增效果有影響。多重PCR與傳統的通過細菌培養鑒定菌的方法相比，具有快速、高效、準確、特異性強的優點；與普通PCR相比具有高通量的優點，多重PCR可節省人力、物力，有助于提高病原菌的檢驗效率。

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