人參皂苷Rg3調控WNT/β-catenin信號通路抑制結腸癌細胞生長的實驗研究

何運元，王 營，王 黎，趙琳琳，徐學軍

(1.徐州醫學院，江蘇徐州271000;2.鄭州大學基礎醫學院，河南 鄭州450052)

人參皂苷Rg3是從天然紅參中提取的單體，近年來的研究［1－2］表明人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖和血管形成的作用，且可在多種腫瘤細胞株中誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的黏附、侵襲，阻止腫瘤轉移的發生。目前，人參皂苷Rg3對于腫瘤細胞作用的分子機制仍未完全闡明。但研究［3－4］顯示人參皂苷Rg3對Wnt/β-catenin信號通路的調節是其發揮抗腫瘤功能的重要途徑，其既能促進β-catenin參與細胞黏附作用，又能抑制β-catenin的核內轉移。而異常激活的Wnt/β-catenin信號通路造成大量β-catenin在核內堆積是許多腫瘤組織突出的分子標志之一。β-catenin在細胞中有2個去向。β-catenin可與α-catenin和細胞膜上的E－鈣黏素形成復合體，并與細胞內肌動蛋白細絲相連，在細胞 －細胞的黏附中發揮重要作用［5］。游離的β-catenin在沒有Wnt信號存在的情況下則進入由糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)和干酪素激酶 Iα(casein kinase Iα，CK Iα)參與組成的降解復合體而被其降解;但如果有Wnt信號存在，后者將阻斷β-catenin的降解，使之在胞質中積聚并轉移到細胞核內。β-catenin在細胞核內通過與轉錄因子T細胞因子和淋巴增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結合而激活下游靶向基因的轉錄［6］。其中一些基因的表達具有已知的促進腫瘤生長的作用，如c-myc、c-jun等。因此當Wnt/β-catenin信號通路過度激活時將會導致腫瘤的發生。結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。在66%～79%的結直腸癌組織中細胞質和細胞核內βcatenin是異常堆積的，而且β-catenin的過表達與腫瘤的浸潤深度及局部去分化有關［7－8］。目前，結直腸癌的化療藥物大多數是作為DNA、RNA、微管合成干擾的非選擇性的細胞分裂抑制劑。這些藥物雖然能有效殺死分裂的惡性細胞，但非選擇性抑制正常細胞的分裂，尤其是一些分裂旺盛的細胞，必然引起嚴重的毒副反應。與此同時，天然小分子藥物以其高選擇性、低毒副反應和可能提高惡性腫瘤臨床療效的優勢，正成為腫瘤治療研究的熱點。而人參皂苷Rg3正是這樣一種針對Wnt/β-catenin信號通路的天然小分子物質，并且我們在利用計算機模擬的針對β-catenin蛋白的藥物篩選模型中發現，人參皂苷Rg3能與這種蛋白結合，其存在可影響β-catenin中特定氨基酸位點的修飾，從而發揮作用。基于以上研究的提示，本實驗通過RT-PCR、Western blot法和流式細胞儀技術來探討人參皂苷Rg3對腫瘤細胞中β-catenin的表達和磷酸化程度影響，同時檢測其對腫瘤細胞增殖和生存的抑制情況，以期為臨床上結腸癌的診治工作提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人結腸癌細胞系HCT116和SW480由第二軍醫大學海軍研究所饋贈。用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養，細胞環境為體積分數5%CO2、37℃的培養箱。

1.2 藥品及藥物制備 人參皂苷Rg3購自中國藥品生物制品檢定所。藥品用DMSO助溶解，制成原液，－20℃保存。用含體積分數10%胎牛血清的DMEM稀釋，使 藥 物 終 濃 度 達 到 10、20、40、80、160、320 μmol·L－1。

1.3 流式細胞儀檢測β-catenin磷酸化水平 收集2×106個細胞，質量分數4%多聚甲醛室溫固定細胞40 min，洗滌離心后用1 mL含體積分數0.2%Triton-X100和體積分數5%血清的PBS重懸細胞，冰上放置10 min;加入飽和劑量FITC標記的一抗，冰上放置40 min，離心去上清，PBS洗滌2次;加入0.5 mL質量分數1%多聚甲醛重懸細胞;流式細胞儀檢測熒光值，每管計數10 000個細胞。

1.4 RT-PCR檢測基因轉錄 SW480細胞常規培養至對數生長期，加入不同濃度人參皂苷Rg3(0、20、80、320 μmol·L－1)，繼續培養 48 h 后，Trizol法提取總RNA，用OD260/OD280鑒定RNA純度，質量分數1%瓊脂電泳鑒定完整性。取2 μg總RNA按TIANGEN公司試劑盒進行逆轉錄，產物cDNA進行PCR。β-catenin引物序列上游:5'-ATGGCTTGGAATGAGAC-3'，下游:5'-AACTGGATAGTCTAGCACC-3'，產物大小 235 bp;β-actin引物序列上游:5'-ACTCGTCATACTCCCTGCTG-3'，下游:5'-GAAACTACCTTCAACTCCC-3'，產物大小285 bp;c-myc引物序列上游:5'-ATCTACACCGACAACTCCATCC-3'，下游:5'-GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC-3'，產物大小130 bp。擴增條件為:94℃變性2 min，94 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個循環，72℃終延伸5 min。PCR電泳，Bio-Rad凝膠成像系統成像，Image Lab 3.0分析其相對分子質量。實驗重復3次。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達 HCT116細胞接種于6孔板中(2×105/孔)，藥物處理48 h。提蛋白并用BSA試劑盒進行蛋白定量。制膠，加樣品和Mark液后通電70 V、40 min，后改為120 V、1 h。轉移蛋白質到硝酸纖維素薄膜，按要求浸泡后按下列順序逐張疊放、精確對齊:3張濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、3張濾紙。插入電極，打開電泳儀開關調至80 mA、4 h。封閉1 h。加入一抗β-catenin 4℃過夜，后加入二抗孵育2 h。最后使用DAB顯色試劑盒，目標蛋白顯色。使用Bio-Rad凝膠成像系統成像，相對灰度值=目的蛋白灰度值/內參蛋白(β-actin)灰度值。

1.6 MTT法檢測細胞增殖 用于研究人參皂苷Rg3對結腸癌細胞增殖的影響。SW480及HCT116細胞種植到96孔板(1×104/孔，密度為60% ～80%)。常規培養24 h后，添加不同藥物濃度的人參皂苷Rg3(10、20、40、80、160、320 μmol·L－1)到 96 孔中，并設定實驗對照及調零孔。體積分數5%CO2、37℃的培養箱中孵育24、48 h后，添加10 μL MTT染液到每個指定的孔中，孵育4 h。隨后每孔加入150 μL DMSO以終止反應和溶解甲臜，最后96孔板在490 nm處測定吸光值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 實驗使用Annexin-V FITC/PI雙染試劑盒。將SW480和HCT116細胞培養至對數生長期，細胞密度約80% ～90%，將細胞培養液換成不同濃度的人參皂苷Rg3(20、40、80、160、320 μmol·L－1)，繼續培養 24、48 h。消化離心，按試劑盒要求加入Annexin V-FITC和PI染色液。在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.8 統計學處理 用SPSS 17.0進行統計學分析，定量數據以±s來表示，2組定量數據比較使用t檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 β-catenin磷酸化程度 各人參皂苷Rg3用藥組(20、40、80、160、320 μmol·L－1)均比對照組的 βcatenin磷酸化程度低(P均＜0.05)，表示隨人參皂苷Rg3濃度的增加，β-catenin磷酸化信號強度明顯減弱。見圖1。

2.2 人參皂苷 Rg3作用48 h后對SW480細胞 βcatenin、c-myc mRNA的影響 隨人參皂苷Rg3濃度的增加，β-catenin mRNA表達無明顯變化，且各人參皂苷Rg3用藥組mRNA相對表達量與對照組比較差異無統計學意義(P均＞0.05);c-myc mRNA表達則是:隨人參皂苷Rg3濃度的增加，c-myc mRNA相對表達量明顯降低，一定濃度的人參皂苷 Rg3(80、320 μmol·L－1)用藥組c-myc mRNA相對表達量與對照組比較差異有統計學意義(P均＜0.05)。見圖2、表1。

表1 Rg3對SW480細胞β-catenin、c-myc mRNA的影響

2.3 人參皂苷Rg3作用48 h后對HCT116細胞βcatenin、c-myc蛋白的影響 隨人參皂苷Rg3濃度的增加，c-myc蛋白表達明顯降低，各人參皂苷Rg3用藥組β-catenin、c-myc蛋白表達量與對照組比較差異均有統計學意義(P均＜0.05)。見圖3、表2。

2.4 細胞增殖實驗結果 不同濃度人參皂苷Rg3處理 SW480 細胞24 h后 IC50為102.027 4 ±3.275 1，48 h后 IC50為 37.096 9 ±0.172 9，下降 64.930 4 ±3.319 2;不同濃度人參皂苷Rg3處理HCT116細胞24 h 后 IC50為 96.591 0 ±0.634 9，48 h 后 IC50為37.445 6 ±1.339 1，下降59.145 4 ±1.498 3。不同時間，同一細胞株各濃度用藥組之間比較差異有統計學意義(P均＜0.05)。同一時間，不同細胞株各濃度用藥組之間比較差異無統計學意義(P均＞0.05)。見圖4。

2.5 細胞凋亡情況 隨人參皂苷Rg3濃度的增加，時間的延長，SW480、HCT116細胞凋亡率顯著增加，各人參皂苷Rg3用藥組與陰性對照組比較差異有統計學意義(P均＜0.05)。不同時間，同一細胞株各濃度用藥組之間比較差異有統計學意義(P均＜0.05)。同一時間，不同細胞株各濃度用藥組之間比較差異無統計學意義(P均＞0.05)。見圖5。

表2 Rg3對SW480細胞β-catenin、c-myc蛋白表達的影響

3 討論

β-catenin可通過與細胞膜上的鈣粘蛋白和細胞骨架的結合發揮重要的維持細胞結構和黏附的作用。那么局限在細胞膜上的β-catenin是否能轉變成為游離形式而成為Wnt/β-catenin信號通路的效應因子這一問題引起了廣泛的關注。研究［9］證明細胞質中的激酶Fer可通過使 β-catenin第142位酪氨酸殘基(Tyr142或Y142)磷酸化而破壞其和α-catenin之間的連接，從而釋放β-catenin。因此，Y142位置的去磷酸化將穩定β-catenin的膜結合形式，從而減少其參與Wnt/β-catenin信號通路，以致減少了下游促癌基因的轉錄。

在本實驗中，我們發現人參皂苷Rg3作用后的HCT116和SW480細胞中的游離β-catenin明顯減少，并且RT-PCR實驗結果也提示這種減少效應并不是發生在轉錄水平上。我們使用特異識別β-catenin磷酸化Y142的抗體，在人參皂苷Rg3作用后，此位點的磷酸化水平下降。結合我們前期工作中預測到的人參皂苷Rg3可與β-catenin結合的模型，我們推測這種結合可以干擾Fer對于Y142的磷酸化過程，使得β-catenin保持穩定的膜結合形式而不能發揮信號通路中的轉錄調節作用，而在腫瘤細胞中則能減少下游一些促進腫瘤發生、發展基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖和促進凋亡的發生，這些也在我們的實驗中得到了證實。另外，在實驗中，人參皂苷Rg3的作用呈現劑量依賴和隨時間增強的特點，說明人參皂苷Rg3可以使游離的β-catenin不斷地轉變成膜結合形式而加強效應，但我們注意到人參皂苷Rg3的效應以80 μmol·L－1為界，在此之前，其抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡的效應隨濃度增加而迅速上升，而在此之后，隨濃度的增加，其效應曲線則趨于平緩，這種現象說明人參皂苷Rg3的效應在80 μmol·L－1時趨于飽和，同時也表明了這種小分子物質是通過與β-catenin結合而影響其功能的。但使游離形式β-catenin轉變的具體途徑和過程還需要通過進一步的實驗進行研究。

人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用具有這樣的機制使之與其他針對β-catenin的靶向治療方法相比，就有一定的優勢。其中一種方法是試圖通過減少β-catenin的表達達到抑制腫瘤細胞生長的目的。例如將干擾RNA分別轉染至含有突變型β-catenin的SW480和HCT116細胞中，可減少β-catenin的表達、β-catenin/TCF介導的轉錄以及很好抑制腫瘤細胞的生長［10］。但這種方法的主要缺陷就是通過抑制β-catenin的表達，不僅減少其游離形式，同時也減少了參與細胞黏附的膜結合形式的數量，從而使得腫瘤組織容易發生浸潤和轉移。而人參皂苷Rg3則是在β-catenin總量不變的情況下，使參與信號通路的游離形式轉變成為膜結合形式，在達到降低β-catenin和靶基因轉錄的同時，還穩定了細胞黏附而減少腫瘤細胞轉移。另外一些方法集中在對β-catenin降解復合體的改造上，這些方法克服了前述方法的缺點，僅減少游離形式的βcatenin，而不影響細胞的黏附作用［11－12］。不過這些方法的復雜給藥方式則阻礙其應用。因此人參皂苷Rg3簡單的給藥方式和便捷的給藥途徑也成為其應用優勢。

綜上所述，人參皂苷Rg3具有一定的抗腫瘤活性，可有效抑制HCT116和SW480細胞生長，且這種作用可能是通過下調β-catenin磷酸化來實現的。相信不久的將來，隨著人們對Wnt/β-catenin信號通路的抗腫瘤機制的深入研究，針對該信號通路的不同靶點和高度特異性的天然小分子藥物的開發將為腫瘤的診治提供一個嶄新的研究領域。

［1］Rice PL，Kelloff J，Sullivan H，et al.Sulindac metabolites induce caspase-and proteasome-dependent degradation of beta-catenin protein in human colon cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(9):885－892.

［2］Danilkovitch-Miagkova A.Oncogenic signaling pathways activated by RON receptor tyrosine kinase［J］.Curr Cancer Drug Targets，2003，3(1):31 －40.

［3］Kim YJ，Kwon HC，Ko H，et al.Anti-tumor activity of the ginsenoside Rk1 in human hepatocellular carcinoma cells through inhibition of telomerase activity and induction of apoptosis［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(5):826 －830.

［4］He BC，Gao JL，Luo X，et al.Ginsenoside Rg3 inhibits colorectal tumor growth through the down-regulation of Wnt/β-catenin signaling［J］.Int J Oncol，2011，38(2):437 －445.

［5］Nelson WJ，Nusse R.Convergence of Wnt，beta-catenin，and cadherin pathways［J］.Science，2004，303(5663):1483 － 1487.

［6］Clevers H.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease［J］.Cell，2006，127(3):469 － 480.

［7］Qi J，Zhu YQ.Targeting the most upstream site of Wnt signaling pathway provides a strategic advantage for therapy in colorectal cancer［J］.Curr Drug Targets，2008，9(7):548 － 557.

［8］Labianca R，Beretta GD，Kildani B，et al.Colon cancer［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2010，74(2):106 －133.

［9］Piedra J，Miravet S，Casta?no J，et al.p120 Catenin-associated Fer and Fyn tyrosine kinases regulate beta-catenin Tyr-142 phosphorylation and beta-catenin-alpha-catenin Interaction［J］.Mol Cell Biol，2003，23(7):2287 －2297.

［10］Verma UN，Surabhi RM，Schmaltieg A，et al.Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2003，9(4):1291－1300.

［11］Cong F，Zhang J，Pao W，et al.A protein knockdown strategy to study the function of beta-catenin in tumorigenesis［J］.BMC Mol Biol，2003，4:10.

［12］Su Y，Ishikawa S，Kojima M，et al.Eradication of pathogenic betacatenin by Skp1/Cullin/F box ubiquitination machinery［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(22):12729 －12734.