RNA干擾抑制人結腸癌SW480細胞EGFR的表達及其對體外生長情況影響的研究

林建安，葉建新，楊樹鋼

(福建醫科大學附屬第一醫院胃腸外科，福建福州350005)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是cerb-B1基因編碼的Src族跨膜受體，酪氨酸激酶是細胞外信號傳遞到細胞內的重要樞紐［1－2］，在腫瘤發展過程中起重要作用，是治療腫瘤的理想靶點，其靶向藥物西妥昔單抗已經應用于臨床且取得了良好的效果，但目前處于平臺期;RNA干擾技術是將與信使RNA(mRNA)對應的外源性小片段RNA導入細胞，與該片段siRNA同源的mRNA發生特異性降解，導致其相應的基因受到抑制的技術，在剔除目標基因上具有特異性、穩定性及高效性等優勢，正成為包括結腸癌在內各種腫瘤基因治療研究中的熱點［3］。本研究利用siRNA方法抑制人結腸癌SW480細胞EGFR基因的表達，并觀察受抑制后人結腸癌SW480細胞體外生長情況的改變。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株SW480購于中國典型培養物保藏中心，RPMI-1640培養基和小牛血清購自GIBCO公司，EGFR抗體購自Santa公司，轉染試劑LipofectamineTM2000和青霉素－鏈霉素液體購自Invitrogen公司，MTT購自Sigama公司，熒光定量RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。EGFR-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司合成。EGFR-siRNA干擾序列見表1。

表1 EGFR-siRNA干擾序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用含體積分數10%小牛血清的RPMI-1640培養基培養，細胞為貼壁生長細胞。細胞傳代時用質量分數0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶2或1∶3傳代，加入培養液后在37℃，體積分數5%的CO2孵箱中培養。

1.2.2 轉染 轉染前一天收集3～5×105細胞接種在6孔板上，2 mL含 小牛血清的RPMI-1640細胞培養基，將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合;輕柔混勻，室溫放置 20 min，以便形成 siRNA/lipofectamin復合物。將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗細胞2遍后，加入2 mL無血清培養基，將500 μL siRNA/lipofectamin復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕搖細胞培養板，孵育4～6 h后，除去復合物，更換培養基，細胞繼續在CO2培養箱中37℃溫育24～48 h后，進行轉染后的其他檢測步驟。

1.2.3 熒光定量 RT-PCR TRIZOL法提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，應用Primer5.0設計引物擴增EGFR基因，上游引物 5'-GAGTTAAGATTTTTTTAAGGGTCCC-3'，下游引物 5'-TAACTGACATGGGTCGGCC-3'，內參基因 β actin，上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，反應體系為 SYBR?Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)6.8 μL，Total 20 μL;反應條件為95℃、30 s然后 95 ℃、5 s，57 ℃、30 s。本實驗采用ABI step one PCR儀(美國生物應用公司產品)。每組實驗重復3次，RT-PCR結果根據靶基因的相對定量按公式得出，靶基因相對表達量 =2－△△Ct。其中△△Ct=(△Ct，Q － △Ct，C)。△Ct，Q 為實驗組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差;△Ct，C為對照組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差［4］。

1.2.4 Western blot法 提取待測細胞蛋白進行定量，將樣品調成相同濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，進行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜上，將膜置于封閉液中于4℃封閉過夜以除去非特異的結合位點，然后一抗孵育，用含1×TBS，洗膜3次，再與二抗孵育，同上洗膜3次。將膜與CDP-Star作為堿性磷酸酶的化學發光底物，與膜室溫下孵育反應5 min后，暗室中X光片曝光、顯影。運用圖像分析軟件Qone對Western blot結果進行分析，以蛋白條帶的灰度掃描比值來表示蛋白的相對表達水平及統計分析。

1.2.5 細胞生長增殖抑制率 采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法，待測細胞經胰酶消化后，調節細胞濃度約為5.0～10×104·mL－1;以每 5.0 ～1.0 ×103個細胞接種于4個96孔培養板中，每孔體積100 μL。設6個復孔，分別培養12、24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L－1)，繼續培養 4 h，加 200 mL DMSO，放置水平搖床15 min后，在490 nm處測定吸光度(A)。細胞生長抑制率=(對照組－處理組)/(對照組－本底)×100%

1.2.6 細胞凋亡檢測 貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集;用PBS洗滌細胞2次(2 000 r·min－1離心5 min)收集1～5×105細胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入 5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應5～15 min;在1 h內，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。用流式細胞儀檢測，激發波長=488 nm;發射波長=530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道檢測;PI紅色熒光通過PI通道檢測。

1.3 統計學處理 運用SPSS 13.0進行統計分析，計量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 EGFR基因的表達 通過引物溶解曲線分析，EGFR基因擴增成功，實驗所獲得數據采用比較CT值法(2－△△t法)進行相對定量分析，實驗結果示:EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA對SW480細胞的mRNA表達與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 2、圖1。

表2 RT-PCR檢測各處理組靶基因抑制情況

2.2 EGFR蛋白的表達 EGFR395-siRNA對EGFR蛋白表達較對照組有顯著性抑制作用(P＜0.05)，EGFR395-siRNA對EGFR的表達較對照組抑制比較差別有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

結果顯示，SW480細胞中的EGFR蛋白在EGFR-395和 EGFR1499-siRNA組的表達下調，EGFR-1211 siRNA和脂質體組、NC組、對照組的表達比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.3 細胞增殖抑制率 不同處理之后，EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA作用于SW480細胞48 h后與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，但由于時間延長，本實驗為瞬轉，siRNA脫靶效應，抑制率逐漸下降。見圖3。

2.4 EGFR-siRNA作用后細胞凋亡率 轉染后各組細胞凋亡率分別為對照組(3.2±0.7)%，EGFR395-siRNA 組(15.8 ±1.2)%，EGFR1211 組(9.5 ±2.1)%，EGFR1499-siRNA 組(14.1 ± 1.7)%;EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA組較對照組凋亡率均高，比較差異均有統計學意義(P均 ＜0.05)。見圖4。

3 討論

EGFR在很多腫瘤組織中過表達。有研究［5］表明70%以上的結腸癌組織中有EGFR高水平表達，EGFR高表達或活性增強與腫瘤增殖、侵襲、轉移、抗凋亡及放化療敏感度下降等許多特性有關，因此研究 EGFR及針對EGFR的治療，成為近年來抗腫瘤治療的熱點。

RNA干擾是近年發展起來的沉默基因的新技術，其是指由雙鏈RNA引發的轉錄后基因沉默機制，通過具有序列特異性的雙鏈RNA或shRNA與靶基因mRNA結合而導致目的基因表達下調，RNA干擾具有高穩定性，高效性，高特異性等特點，目前RNA干擾在癌基因組功能研究和腫瘤基因治療中已顯示出效果。

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習慣和飲食結構的改變以及人口老齡化，我國結腸癌的發病率和死亡率均保持上升的趨勢［6］。EGFR的研究已經取得重大突破，其靶向藥物西妥昔單抗已經應用于臨床且取得良好的效果，但目前處于平臺期。由于腫瘤基因治療較少涉及倫理問題，加之臨床治療的迫切需要，腫瘤發生的分子機制及其基因治療也已走在基因治療的前列。

本實驗是EGFR與RNA干擾技術相結合，探索RNA干擾EGFR的mRNA后對SW480細胞的體外干擾情況的研究，通過RT-PCR、Western blot法檢測到EGFR基因的mRNA和蛋白的表達明顯抑制，證實序列特異性的EGFR-siRNA能顯著抑制EGFR基因的表達，并通過MTT和流式細胞學檢測細胞增殖與凋亡，表明siRNA可以抑制 SW480細胞的增殖，并促進SW480細胞凋亡。本文結果顯示，以EGFR為靶點的RNA干擾能明顯抑制 SW480細胞中EGFR基因的表達，調控細胞周期，促進細胞凋亡，為結腸癌的基因沉默療法提供了新的思路，更為以 EGFR基因為靶基因的RNA干擾技術由基礎到臨床的應用提供理論依據。

［1］Su LK，Johnson KA，Smith KJ，et al.Association between wild type and mutant APC gene products［J］.Cancer Res，1993，53(12):2728－2731.

［2］Nicholson RI，Gee JM，Harper ME.EGFR and cancer prognosis［J］.Eur J Cancer，2001，37 Suppl 4:S9 － S15.

［3］馮作化，藥立波，周春燕，等.醫學分子生物學［M］.北京:人民衛生出版社，2007:172，314

［4］Higuchi R，Fockler C，Dollinger G，et al.Kinetic PCR analysis:real-time monitoring of DNA amplification reactions［J］.Biotechnology(NY)，1993，11(9):1026 －1030.

［5］Wu X，Deng Y，Wang G，et al.Combining siRNAs at two different sites in the EGFR to suppress its expression，induce apoptosis，and enhance 5-fluorouracil sensitivity of colon cancer cells［J］.J Surg Res，2007，138(1):56 －63.

［6］曾益新.腫瘤學［M］.2版.北京:人民衛生出版社，2003:536－559.