茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟纖維化的保護作用研究

赫長勝 李源淵 岳洪義 薛 峰 劉 健

1.山東省青島市膠州中心醫院肝膽外科，山東青島 266300；2.河北省保定市第一人民醫院兒科，河北保定 071000

茵陳為菊科多年生草本植物濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分，具有清利濕熱、利膽退黃之功效，是我國傳統醫學治療黃疸的主要藥物之一。近年來的研究結果顯示，茵陳中含有多種有效成分及微量元素[1-2]，其中多糖是其主要組分之一，本文就茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟纖維化損傷的保護作用進行研究，為中藥茵陳的開發利用及梗阻性黃疸的臨床資料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

茵陳多糖（本課題組自制），肝臟組織層粘連蛋白（laminin，LA）、透明質酸酶（hyaluronidase，HA）、Ⅲ型前膠原（Type Ⅲ pro collagen，PC-Ⅲ）及Ⅳ型膠原（typeⅣ collagen，Ⅳ-C）檢測試劑盒（購自天津原子能公司），放射免疫計數器（購自天津原子能公司）。

1.2 動物及分組

Wistar大鼠40只，清潔級，雌雄不拘，3～4周齡，體重80～100 g，由河北聯合大學醫學實驗動物中心提供，動物生產許可稱號：SCXK（京）2009-0004。20℃左右室溫條件下適應性喂養7 d后隨機分為四組，對照組、模型組、茵陳多糖高劑量組（高劑量組）、茵陳多糖低劑量組（低劑量組），每組10只。

1.3 動物模型的建立與干預

模型組、高劑量組、低劑量組動物于造模前禁食12 h，禁水4 h，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后，常規消毒腹部皮膚，行上腹正中切口，暴露并游離膽總管，用絲線將膽總管中上段雙重結扎，而后關腹；對照組僅暴露并游離膽總管，不結扎。各組大鼠于術后當天起，分別給予相應的藥物進行干預，高、低劑量干預組幼鼠鼠分別灌胃茵陳多糖0.8、0.4 mg/kg，每日1次，對照組、模型組大鼠灌胃同體積生理鹽水，分籠飼養，自由進食飲水。

1.4 生化指標的檢測

術后2周對相應組別的幼鼠以乙醚吸入麻醉后，剪開右頸部暴露頸靜脈，行頸靜脈取血，分離血清，按試劑盒說明書操作規程測定血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、直接膽紅素（ndirect bilirubin，DBIL）含量。

1.5 肝組織勻漿制備

幼鼠處死后立即開腹采集肝臟標本，制備肝組織勻漿，冰鹽水漂洗、剪碎，制備組織勻漿，勻漿介質（蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，EDTA-2Na 0.01 mol/L，Tris-HCL 0.1 mmol/L，0.8%NaCl溶液，蔗糖0.01 mmol/L），組織勻漿后低溫高速離心，上清液待測。

1.6 LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C 的檢測

LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C檢測采用放射免疫法，檢測過程嚴格按照儀器及試劑使用說明書進行。

1.7 肝臟組織病理標本制備及觀察

肝臟組織病理標本制備采用肝中葉組織，常規方法固定包埋，4 μm厚度切片，HE染色，100目光鏡觀察拍片。

1.8 統計學方法

數據處理采用SPSS 17.0統計學軟件，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠肝臟組織病理標本比較

對照組大鼠肝臟形粉褐色態飽滿，邊緣銳利，質地柔軟，分葉清晰，鏡檢見肝臟組織結構清晰，肝小葉、匯管區及肝竇形態正常，分布均勻（圖1A），模型組大鼠肝臟形態不規則，邊緣圓鈍，肝臟黃染，鏡檢可見肝臟小葉點片狀壞死，肝小葉間隙增寬，纖維組織增生，竇間隙及肝竇中炎癥細胞增多（圖1B）。低劑量組及高劑量組肝臟形態規則，肝臟黃染及變形較模型組輕，光鏡檢查可見肝臟小葉壞死少見，肝小葉間隙增寬，纖維組織增生及炎癥細胞浸潤較模型組輕（圖 1C、D）。

2.2 茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟生化指標的影響

造模2周后，模型組、高、低劑量組幼鼠血清AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平升高， 高、 低劑量組 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL水平低于模型組 （P<0.05）， 高劑量組 TBIL、DBIL、IBIL水平低于低劑量組（P<0.05）。見表1。

2.3 茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝組織勻漿中肝纖維化指標的影響

造模2周后，模型組大鼠血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度高于對照組，低劑量組及高劑量組血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于模型組（P<0.05），高劑量組血清HA及Ⅳ-C濃度低于低劑量組（P<0.05）。見表2。

3 討論

梗阻性黃疸是臨床的常見疾病，多由于膽道腫瘤、結石及先天性畸形導致的膽道梗阻引起，膽道梗阻后引起膽汁排泄障礙，膽道壓力增高，繼發膽汁分泌障礙，伴隨膽道的壓力增高，膽汁逆流入血，引起梗阻性黃疸及肝臟組織結構的損傷及膽色素代謝障礙，膽色素具有細胞毒性，梗阻性黃疸能夠引起多器官功能及結構的損傷，其中以肝臟結構及功能損傷最為突出，嚴重者可以引起膽汁性肝纖維化及肝硬化，導致肝臟儲備功能下降，甚至功能衰竭，因此梗阻性黃疸患者肝功能的保護及防止繼發性的肝臟纖維化性損傷是梗阻性黃疸患者圍術期治療關鍵問題之一。

表1 各組幼鼠血清生化指標比較（±s，n=10）

表1 各組幼鼠血清生化指標比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

組別 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L） IBIL（μmol/L） DBIL（μmol/L）對照組模型組高劑量組低劑量組83.41±9.67 699.46±72.38*496.34±52.81*#513.46±53.25*#39.98±4.88 269.98±30.78*149.51±16.28*#152.58±16.31*#4.39±0.54 227.46±23.18*87.38±9.38*#109.06±10.87*#■3.71±0.46 97.98±10.03*32.52±3.42*#46.54±4.72*#■3.79±0.47 64.38±6.52*29.78±3.05*#32.28±3.94*#

表2 各組幼鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標比較（±s，n=10，ng/mL）

表2 各組幼鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標比較（±s，n=10，ng/mL）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

組別 LA HA PC-Ⅲ Ⅳ-C對照組模型組高劑量組低劑量組51.92±6.04 95.46±11.49*70.14±8.06*#77.29±9.13*#714.35±22.16 1 516.42±133.09*1 059.45±106.94*#1 256.42±117.09*#■68.42±9.25 138.46±11.54*80.02±8.79*#86.54±10.26*#29.28±5.14 54.29±6.02*28.50±5.16*#45.06±6.27*#■

茵陳是我國的傳統中藥，具有利膽退黃作用，以茵陳為主要成分的中藥在黃疸的治療中具有獨特的作用，近年來的藥理學研究結果顯示，在茵陳中含有多種組分，其中多糖是有效的組分之一[3]。研究顯示，茵陳的多糖組分具有抗氧化作用，能夠清除DPPH等氧自由基[4]，減少組織及細胞的氧化損傷。氧自由基大量生成是梗阻性黃疸肝臟損傷原因之一，茵陳多糖的抗氧化作用可能是其發揮肝臟保護作用的機制之一。此外，研究表明[5-6]，多糖能降低肝纖維化鼠肝組織的膠原沉積，減少前膠原纖維的表達，改善肝纖維化，也能夠通過抑制肝纖維化大鼠肝細胞的TGF-β表達和下調Smad 3的表達發揮抗肝臟纖維化作用。

筆者在研究中發現，給予茵陳多糖干預后，高、低劑量組幼鼠 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平低于模型組，說明茵陳多糖能夠改善梗阻性黃疸大鼠的肝臟損傷，同時在高低劑量組之間TBIL、IBIL水平表現出明顯的差異，說明茵陳多糖對梗阻性黃疸肝臟損傷的保護作用具有明顯的量效關系。在進一步的研究中發現，梗阻性黃疸能夠引起幼鼠的肝臟纖維化，在結扎膽總管2周后幼鼠的肝臟纖維化指標LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C均有不同程度提高，低劑量組及高劑量組血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于模型組，而且在高低劑量組之間也存在顯著差異，說明茵陳多糖能夠減輕梗阻性黃疸引起的肝臟損傷，改善肝臟纖維化。

[1]石玉平，馮瑛，王永寧，等.微波消解-電感耦合等離子體質譜法測定藏茵陳中的微量元素[J].化學試劑，2000，33（11）：1019-1020，1044.

[2]胡彥武，關穎麗，姚慧敏，等.野生綿茵陳和花茵陳中綠原酸含量的比較[J].中國實驗方劑學，2011，17（9）：78-80.

[3]劉曉河，梁惠花，譚曉紅.茵陳中多糖的含量測定[J].中草藥，2003，34（6）：519-520.

[4]戴喜末，熊子文，羅麗萍.響應面法優化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究[J].食品科學，2011，32（8）：93-97.

[5]周程艷，艾凌艷，王美，等.杜仲多糖抗肝纖維化作用的實驗研究[J].中草藥，2011，42（2）：324-329.

[6]施磊，李俊，王佳佳，等.屏風多糖對大鼠肝纖維化保護作用的實驗研究[J].安徽醫科大學學報，2010，45（5）：651-654.