宿主蛋白殘留檢測及數據分析中存在的問題

北京市藥品審評中心（100053）徐春娥 田曉娟 劉鶴 佟利家

宿主殘留蛋白（Host Cell Protein，以下簡稱為HCP），是指在生物制品中殘留的宿主蛋白。這類蛋白成分復雜，種類繁多，且會因生產過程及純化工藝的不同而發生變化。基因工程產品中殘留的宿主細胞蛋白是影響制品純度的重要因素，反復使用含宿主細胞蛋白的基因工程制品，有可能會引起機體的過敏反應，而且其具有潛在的“佐劑效應”，也可能引起機體對藥物產生抗體，進而影響藥物的療效。HCP在生物制品中的殘留量反映的不僅是制品批間的一致性，而且還是衡量生物制品質量的一個重要指標。

目前，HCP檢測使用的方法包括酶聯免疫法（ELISA）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、毛細管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）和高效液相層析（HPLC）等。Capito F等報告[1]，采用傅立葉轉換紅外光譜學（Fourier transform mid infrared spectroscopy，FT-MIR）可以對重組蛋白純化過程中的大量（20μg/mL～200μg/mL）宿主殘留蛋白進行監控。目前，《中國藥典》[2]三部（2010版）中對于大腸桿菌、酵母、假單胞菌表達的蛋白質的HCP檢測，采用的是雙抗夾心ELISA法，《美國藥典》[3]中規定使用SDS-PAGE或免疫測定法。而另有一些生物制品公司，如美國Cygnus technologies（賽納斯科技）公司研究開發了一系列HCP檢測試劑盒，國內采用的一般表達宿主蛋白殘留檢測多數使用商品化的檢測試劑盒；對于尚沒有標準品的表達宿主，廠家則需要建立這類表達宿主的內部參考品。

商品化檢測試劑盒一般都是經過嚴格的生產工藝方法學驗證的，并進行了嚴格的產品性能評估，每個試劑盒都有與此產品匹配的最適合的計算方法，試劑盒中對結果的分析方法進行了嚴格的限制，要求在試劑盒規定的稀釋度范圍內進行測量，并且采用所要求的方法進行數據分析才能得到準確的數值，如point-to-point（點對點）、cubic spline（三次樣條曲線）和四參數對數法等。因此，在使用商品化試劑盒時，應嚴格按照說明書進行操作。筆者在進行原始記錄核查時發現，有些研究單位在進行宿主蛋白殘留檢測結果分析時，未嚴格按照試劑盒說明書要求進行數據分析。而申請人一般會將說明書中要求的point-to-point 簡單的理解為直線回歸分析方法，習慣采用直線回歸分析方法和兩點間直線分析方法，這樣就會導致計算的結果不夠準確。此外，也不能準確的反映測定方法中自變量和因變量之間的關系。現以兩例核查中發現的未按照規定方法進行分析的實際案例為例進行分析，以提請相關檢測人員的注意。

例1：注射用生物制品A表達宿主為293T細胞，制造檢定規程要求成品宿主蛋白殘留量低于50ng/劑量。申請人使用的是Cygnus生產的293細胞蛋白殘留檢測試劑盒，要求在規定的稀釋度范圍內進行測量，并且采用如point-to-point（點對點）、cubic spline（三次樣條曲線）或四參數對數法進行分析，而申請人卻采用了直線回歸分析方法進行測定。宿主蛋白殘留檢測原始數據見附表1。

附圖1 采用Cubic Spline方法進行數據分析的標準曲線

附圖2 第一次測量和第三次測量的標準曲線（Cubic Spline法）

附圖3 第二次測量的標準曲線（Cubic Spline法）

附表1 注射用生物制品A中三批成品的宿主蛋白殘留檢測原始數據

附表2 注射用生物制品A采用不同分析方法檢測殘留蛋白的結果對比

附表3 某注射用生物制品B原液3次宿主蛋白殘留檢測的原始數據

附表4 某注射用生物制品B原液3次宿主蛋白殘留檢測采用不同分析方法的結果對比

采用試劑盒中要求的分析方法之一—Cubic Spline進行分析，標準曲線見附圖1，曲線方程為：y=-24.093+345.5817x-341.7936x2+407.1602x3。注射用生物制品A采用直線回歸分析方法與Cubic Spline分析方法進行分析，兩種分析方法結果對比見附表2。

從附表2中的結果可以看出，采用Cubic Spline方法進行分析時，三批成品的293細胞宿主蛋白殘留量分別為25.19ng/劑量、26.93ng/劑量和24.64ng/劑量，原分析方法采用線性回歸分析法，數據分別為25.91ng/劑量、27.50ng/劑量和25.36ng/劑量，所得結果差異不大，均低于該品50ng/劑量的質量控制標準，符合該品制造檢定規程要求。

例2：某注射用生物制品B原液要求檢測宿主殘留蛋白，表達宿主為巴斯德畢赤酵母，制造檢定規程規定宿主殘留蛋白應不高于蛋白質總量的0.050%。申請人使用的是Cygnus生產的酵母蛋白殘留檢測試劑盒（原始數據見附表3）。采用試劑盒中要求的分析方法之一—Cubic Spline進行分析，第一次測量和第三次測量所得的標準曲線相同（見附圖2），曲線方程為：y=-3.6553+145.4702x+136.8839x2-1 0 2.8 3 6 4 x3；第二次測量的標準曲線見附圖3，曲線方程為：y=7.6 4 5 4-388.3606x+6171.5782x2-14154.8888x3，而申請人卻采用了直線回歸分析方法進行分析，兩種分析方法結果對比詳見附表4。

根據計算結果我們可以看出，采用Cubic Spline方法對同一批原液進行三次測量，與直線回歸分析方法相比，雖然得出的結果均在其質控標準范圍內，即宿主殘留蛋白均不高于蛋白質總量的0.050%，第一次和第三次測量兩種方法的分析結果差異不大，而第二次測量結果卻出現較大偏離。

通過分析標準曲線可知，在數值較高部分和較低部分通常不是線性的，抗原或抗體濃度過高時，對應的ELISA讀數不會再顯著升高，這時會達到一個平臺期，同樣在低濃度時也有一個平臺期，只有在適當的濃度時才會出現類似直線的曲線。

在上述兩個例子中，由于數據落在近似直線的區域，采用直線回歸的方法與試劑盒要求的方法分析結果沒有明顯的差異，而當所測量數值落在標準曲線數值較高部分或較低部分時，如果使用線性回歸分析就會導致結果偏高或偏低，出現較大的誤差。因此，在實際分析中應該嚴格按照試劑盒說明書要求對所得數據要進行多參數擬和，這樣才能得到準確反映實驗結果的曲線，從而回歸出準確的結果。（注：本文所引用原始數據已經與申請人溝通，同意使用）