海南新紀錄種東方蜈蚣藻(紅藻門)的形態學觀察和rbcL基因序列分析

張 雯, 王宏偉, 趙 丹, 盛英文, 欒日孝

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

海南新紀錄種東方蜈蚣藻(紅藻門)的形態學觀察和rbcL基因序列分析

張 雯1, 王宏偉1, 趙 丹1, 盛英文1, 欒日孝2

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

通過形態結構觀察、生殖器官的發育和rbcL序列分析相結合的方法, 發現了分布于海南省陵水新村的東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)為海南新紀錄種, 該物種具有以下特征： 藻體質地凝膠狀或軟骨質; 皮層外部由5～6層念珠狀的細胞構成, 內部由1～2層星形細胞構成; 生殖枝叢由兩個分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內。

海膜科(Halymeniaceae); 東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang); 新紀錄種;形態學觀察; rbcL

蜈蚣藻屬(Grateloupia C.Agardh)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)隱絲藻目(Cryptonemiales)海膜科(Halymeniaceae), 由 C.Agardh在 1822年基于Grateloupia ornata C.Agardh, G. hystrix C.Agardh和G. filicina (Lamouroux) C.Agardh這3種建立的,是海膜科最大的一個屬[1]。屬模為 G.filicina(Lamouroux) C.Ag., 主要特征是藻體直立,淡紅黃色或紫紅色, 黏滑或軟骨質, 多軸構造。分為皮層和髓部, 中央髓部由縱走髓絲錯綜交織著,外圍皮層由圓形、橢圓形或不規則細胞組成, 背斜排列。有性藻體雌雄同體或異體, 精子囊群由雄配子體的外皮層細胞形成, 圓柱狀, 無色。果孢枝與輔助細胞分別由雌配子體的內皮層細胞產生的枝絲中形成。成熟囊果埋于皮層中, 成顆粒狀, 突出于藻體表面。四分孢子囊由孢子體的外皮層細胞形成, 十字形分裂[2]。蜈蚣藻屬廣泛分布于世界各地的沿海, 全世界報道有約80種[3-10], 中國共報道32種[2]。

作者對海南沿海蜈蚣藻屬資源調查時, 對采自海南陵水新村的編號為 LNU092102和 LNU092103的標本進行了形態結構觀察和 rbcL基因序列分析,發現與2008年林繡美等[11]報道的產自臺灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)完全一致, 由于在海南省為首次發現, 因此確認該種為海南新紀錄種。

1 材料與方法

1.1 形態學觀察

材料采自海南省陵水新村。分別制作成臘葉標本、10%福爾馬林溶液液浸標本和硅膠干燥標本, 用于形態觀察、制作冰凍切片和DNA提取。其中, 冰凍切片用 0.5% (w/v)的甲基藍染色, 并用 Olympus BH2數字顯微鏡觀察, 用Nikon HFX-ⅡA照相機拍照記錄結果。標本保存于遼寧師范大學生命科學學院植物標本室中(LNU)。

1.2 分子序列分析

DNA的提取、PCR擴增以及引物設計參照Wang等[4]并改進的方法。引物組合方式為： (1)F8—R1381-ii, (2)F1—R1150, F735—R1381-ii(表 1)。

從 GenBank 網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下載并選取了16個物種的基因序列進行rbcL序列分析(表 2), 包括 14個蜈蚣藻屬(Gratelouopia)的物種, 2個外群物種(Halymenia floresia, Polyopes constrictus)。MEGA 4.0軟件用于進行堿基差異度的分析以及系統樹的構建, Bootstrap值為 1000。采用Kimura的雙參數法計算距離矩陣[12], 采用NJ(Neighbor-Joining)法和 MP(Maximum Parsimony)法構建系統樹。

表1 rbcL序列擴增所需引物Tab. 1 Primers used for amplifying rbcL sequences

表2 rbcL序列分析所用海藻種類和基因庫編號列表Tab. 2 The species used for rbcL sequence analysis and gene number list

2 結果

2.1 藻體外部形態

藻體深紅色或棕色, 凝膠狀或軟骨質, 由 1～15個圓柱狀或亞圓柱狀的主枝組成, 高達16 cm, 基部具圓餅狀的固著器, 直徑2～7 mm。單生或數個集生在一起, 集生藻體的固著器緊密連接在一起。主枝長5～12 cm, 常為亞圓柱狀, 直徑 0.7～1.5 mm×2～3 mm,具有不規則的羽狀分枝, 分枝長 8～20 mm, 直徑0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 配子體和四分孢子體是同型的(圖1a和圖1b)。

圖1 東方蜈蚣藻Fig. 1 External morphology of G.orientalisa. 雌配子體(LNU092102); b. 四分孢子體(LNU092103)a. Female gametophyte (LNU092102); b. Tetrasporic plant (LNU092103)

2.2 內部結構

幼體和成熟藻體的內部結構有細微的變化。幼枝內部中空, 髓絲松散排列, 外皮層由四到五層念珠狀的細胞構成(圖2a)。隨著分枝直徑的增加, 外皮層細胞經縱向和橫向的分裂, 成為六到八層細胞, 髓絲伸長并緊密纏繞在一起, 由次生紋孔聯系相連接。

圖2 東方蜈蚣藻的橫切面結構和生殖結構(ac代表輔助細胞)Fig. 2 Transverse section and reproductive structures of G. orientalis.(The ac is auxiliary cell )a. 雌配子體橫切面觀; b～c. 輔助細胞生殖枝叢切面觀; d～e. 囊果的發育; f～g. 正在分裂的四分孢子; h. 成熟的四分孢子囊a. Cross-section through a branchlet female gametophyte; b～c. Lateral view of mature auxiliary cell ampulla; d～e. Developing cystocarp;f～g. Dividing tetrasporangium; h. Fully developed tetrasporangium

2.3 生殖結構

果孢枝和輔助細胞生殖枝叢分別始于基部和近基部的內皮層(圖 2b)。輔助細胞原始生殖枝叢橫向分裂形成一個長達三個細胞的長度的枝絲, 果孢枝和輔助細胞生殖枝叢繼續分裂并向外皮層延伸。當原始生殖枝叢達到 5～6個細胞的長度, 次生生殖枝叢的第一個細胞擴大, 行使輔助細胞的功能。受精后, 受精卵核通過聯絡絲從果孢枝生殖枝叢發出,到輔助細胞。果孢枝和輔助細胞生殖枝叢在外形上相同。一個完整發育的輔助細胞生殖枝叢有兩個分枝, 每個分枝可達 7～10個細胞的長度(圖 2b和圖2c)。

輔助細胞接受了受精卵核后, 經橫分裂, 產生一原產孢絲細胞, 由它連續斜分裂形成產孢絲基部細胞。基部細胞繼續橫分裂, 形成產孢絲。當產孢絲聚集到 5～6個細胞的時候, 在輔助細胞和產孢絲之間的紋孔聯系擴大。接著, 產孢絲基部細胞與第一次分裂后的輔助細胞融合, 形成一個小的融合胞。髓絲和融合胞之間形成次級紋孔聯系。產孢絲附近的髓絲逐漸纏繞, 并通過次級紋孔聯系相互連接形成一個絲狀囊果被, 頂端有時可以看到一囊孔。產孢絲從末端開始成熟, 最后形成為梨形或橢圓形的果孢子囊。成熟囊果中, 產孢絲除基部細胞外全部形成果孢子囊, 寬 9～10 μm, 長 11～12 μm(圖 2d-e)。

四分孢子始于內皮層細胞, 十字形分裂(圖2f-h)。成熟的四分孢子囊長 34～38 μm, 寬 12～15 μm。精子囊母細胞由表皮細胞形成, 第一次縱向分裂, 伸長,再橫分裂, 產生精子囊。

2.4 東方蜈蚣藻與其相似種的形態學比較

通過東方蜈蚣藻與其相似種進行形態學特征比較(表 3), 可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨： 東方蜈蚣藻具不規則羽狀分枝; 繁枝蜈蚣藻具不規則叉狀分枝或互生分枝。東方蜈蚣藻和蜈蚣藻(G. filicina)在外形上較難分辨, 且東方蜈蚣藻曾經被當作G. filicina[13-14]研究, 但是, 可以通過其藻體直徑和皮層數分辨： 東方蜈蚣藻藻體直徑為0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 皮層為 6～9 層;G. filicina藻體直徑為350～450 μm, 皮層為5～8層。東方蜈蚣藻與鏈狀蜈蚣藻在外形上極為相似, 很難分辨。

習性： 生長在中、低潮帶巖石上或潮下帶0.5～2 m的巖石上。產地： 中國海南省陵水新村、中國臺灣林園模式標本產地： 中國臺灣林園

表3 東方蜈蚣藻及其近似種的形態學比較Tab. 3 Comparison of morphological features between Grateloupia orientalis and its similar species

2.5rbcL分析

全序列比對結果如表 4所示。編號為LNU092102和 LNU092103的標本與東方蜈蚣藻三者之間無堿基差異, 與屬模蜈蚣藻(G. filicina)的堿基差異為 8.2%(72 bp), 與繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)的堿基差異為 8.3%(73 bp), 與鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)的堿基差異為 8.1%(67 bp), 與蜈蚣藻屬內其他各種的堿基差異為 8.65%～9.3%(79～91 bp), 與外群(Polyopes lancifolius,Halymenia floresia)的堿基差異為 10.0%～10.4%(118～127 bp)。

圖3 NJ法構建的系統發育樹Fig. 3 The phylogeny tree based on Neighbor-Joining比例尺為0.01, 表示遺傳距離; 分支上的數字表示支持率(1000次重復), 支持率小于50%的沒有給出Scale bar=0.01 substitutions per site. Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

圖4 MP法構建的系統發育樹Fig. 4 The phylogeny tree based on Maximum Parsimony分支上的數字表示支持率, 支持率小于50%的沒有給出Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

從NJ系統樹(圖3)和MP系統樹(圖4)中可以看出, 18個海膜科的物種聚集為3個大的進化支, 其中,編號為LNU092102, LNU092103的標本與蜈蚣藻屬內的其他各種聚集為一個大的進化支, 與蜈蚣藻屬中的屬模蜈蚣藻(G. filicina)、東方蜈蚣藻(G. orientalis)、繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)、鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)形成一個小分支, 并與東方蜈蚣藻(G. orientalis)組成一個單獨的分支, 區別于其他物種, 其支持率達100%。

3 討論

蜈蚣藻屬(GrateloupiaC.Agardh)是海膜科(Halymeniaceae)中最大的一個屬, 其外部形態變化很大。許多分類學家都不同程度地對蜈蚣藻屬做了分類學研究。

2008年, 林繡美等[11]首次報道了分布在臺灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalisS.-M. Lin et H.-Y.Liang), 并描述了該種的形態結構特征。本文采用形態結構觀察和rbcL基因序列分析相結合的方法,對海南沿海蜈蚣藻資源進行了調查, 發現編號為LNU092102和 LNU092103的海藻樣本的形態結構特征與林繡美報道過的東方蜈蚣藻相同, 經rbcL基因序列分析, 二者無堿基差異, 并且在系統樹上也聚為一個進化支, 因此斷定該種即為東方蜈蚣藻。由于該種只在中國臺灣有過報道, 在海南省為首次發現, 故將其確定為海南新紀錄種。

對該藻進行的內部結構觀察的結果顯示, 其果孢枝細胞和輔助細胞生殖枝叢是典型的蜈蚣藻型,并與東方蜈蚣藻具有相同的結構特點： 藻體質地凝膠狀或軟骨質; 皮層外部由 5～6層念珠狀的細胞構成, 內部由1～2層星形細胞構成; 生殖枝叢由兩個分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內;受精后, 產孢絲細胞鄰近的內皮層細胞, 產生次生髓絲, 最后發育為囊果被。

通過東方蜈蚣藻與其相似種的形態學特征比較,可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨, 與蜈蚣藻(G. filicina)和鏈狀蜈蚣藻在外形上較難分辨,但與蜈蚣藻(G. filicina)可通過藻體直徑和皮層數分辨開來。

rbcL序列分析的結果顯示, 編號為LNU092102和LNU092103的標本與東方蜈蚣藻的序列相似度高達100%, 與其外形相似的繁枝蜈蚣藻、蜈蚣藻以及鏈狀蜈蚣藻的差異為種間差異, 與海膜科內海膜屬(Halymenia)和海柏屬(Polyopes)的差異較大, 超過了種間差異的范圍。在基于rbcL基因(1381 bp)序列的系統發育樹(圖3和圖4)中可以看出, 該藻與東方蜈蚣藻聚成了一個單獨的分支, 區別于其他種類, 并且, 東方蜈蚣藻與蜈蚣藻屬內的其他種形成了一個大的進化支。這不僅證明了該藻與東方蜈蚣藻是同一物種, 也進一步驗證了東方蜈蚣藻 是蜈蚣藻屬內的一個獨立的物種。

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Morphological observation and rbcL gene sequence analysis of Grateloupia orientalis (Rhodophyta), a new record of the Hainan province

ZHANG Wen1, WANG Hong-wei1, ZHAO Dan1, SHENG Ying-wen1,LUAN Ri-xiao2
(1. College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Dalian Natural History Museum, Dalian 116023, China)

Nov.,12,2011

halymeniaceae; Grateloupia orientalis; new record; morphological observations; rbcL

The Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang collected from Lingshui, Hainan province has been confirmed to be a new record in the Hainan province through morphological observations, development of reproductive structures and molecular phylogenetic studies. This species has the following morphological features：Thallus are gelatinous to cartilaginous in texture; cortex is composed of five to six layers of outer moniliform cells and one to two layers of stellate-shape inner cells; ampullae is composed of only two orders of unbranched filament;carposporangia distribute in all the cortex except the bottom of thallus.

Q943

A

1000-3096(2012)07-0109-08

2011-11-12;

2012-03-23

國家自然科學基金項目(30870161)

張雯(1986-) 女, 山東萊蕪人, 碩士研究生, 從事海藻分類學研究, E-mail： zhangwen111213@126.com; 王宏偉, 通信作者, 教授,博士, 從事海藻分類、多樣性及其分子系統學研究, E-mail： kitamiwang@yahoo.com.cn

(本文編輯：梁德海)