兩種前處理方法提取辣椒中辣椒堿的最優(yōu)工藝研究

張百剛，劉曉風(fēng)，盧利寧

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300222）

兩種前處理方法提取辣椒中辣椒堿的最優(yōu)工藝研究

張百剛1，劉曉風(fēng)1，盧利寧2

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300222）

以辣椒為原料，分別用纖維素酶乙醇提取法和超聲波乙醇提取法對辣椒中的辣椒堿進(jìn)行了提取并研究了兩種工藝的最優(yōu)工藝參數(shù)。實驗結(jié)果表明:酶法提取的最優(yōu)工藝條件為:酶解液初始pH 5.5，酶量9mg/g，酶解時間1h，酶解溫度40℃，此條件下辣椒堿的提取率為0.795%;超聲波輔助提取最優(yōu)條件為溫度70℃，乙醇濃度70%，超聲波功率60W，料液比1∶11，此條件下辣椒堿的提取率為1.271%。

辣椒堿，纖維素酶，超聲波

辣椒堿是一種香草酰胺類生物堿。其具有消炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)脂肪代謝、催淚催嚏、促進(jìn)食欲、改善消化、抗菌殺蟲及對神經(jīng)遞質(zhì)的選擇性等藥理作用［1］。近年來對辣椒堿的開發(fā)已不僅僅局限于食品行業(yè)，已逐步擴(kuò)展到醫(yī)藥、軍事和環(huán)保化工領(lǐng)域，成為國際上的研究熱點。目前辣椒堿的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、超臨界二氧化碳流體萃取法等，前者耗時長，操作復(fù)雜;而后者設(shè)備投資大，成本高。我國目前辣椒堿產(chǎn)量很小，市場缺口大。作為較新的提取方法，纖維素酶法和超聲波輔助法已成功應(yīng)用于橙皮苷、多糖、黃酮及色素等提取方面［2－3］，具有較高的提取效率，且設(shè)備要求低，成本低。因此，對于此二者的研究有利于辣椒堿生產(chǎn)的工業(yè)化轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

干紅辣椒 市售;香蘭素、鉬酸鈉、鎢酸鈉、85%磷酸、氫氧化鈉、無水乙醇、纖維素酶（1g，＞15u/mg）、36%乙酸、無水乙酸鈉、無水碳酸鈉、鉬酸鈉、鎢酸鈉、磷酸 均為分析純。

UV－9200型紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;DT1000電子天平 江蘇常熟市衡器廠;KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;SHB－IIIA型循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工有限公司;RE52－86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣椒堿的定量測定

1.2.1.1 磷鎢酸－磷鉬酸溶液的配制 稱取100g鎢酸鈉和20g磷鉬酸（不含硝酸根離子和銨根離子），準(zhǔn)確加入60mL 85%糖漿狀磷酸和700mL蒸餾水，微火煮沸2h，冷卻后過濾，放入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容［4］。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取香蘭素0.0005g（相當(dāng)于純辣椒堿0.0010g），用0.1mol/L NaOH配制100mL，此液1mL=10μg辣椒堿，即為母液。分別吸取以上標(biāo)準(zhǔn)液 5、10、15、20、25mL，用 0.1mol/L NaOH溶解并定容至50mL容量瓶中，每毫升分別相當(dāng)于1、2、3、4、5μg辣椒堿。取上述五種溶液各 5mL 于50mL容量瓶中，各加5mL磷鎢酸－磷鉬酸溶液，振搖均勻后，再加約30mL飽和碳酸鈉溶液，充分振蕩至有白色沉淀生成，用飽和碳酸鈉溶液定容至50mL刻度，搖勻后靜置2h（實驗說明標(biāo)準(zhǔn)液、試樣液顯色1.0h可達(dá)高峰。顯色液在顯色2h內(nèi)穩(wěn)定，樣液顯色3h后色度開始下降）。將顯色液離心分離沉淀物在660nm處用1cm的比色皿，測定吸光度A。以辣椒堿含量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時以0.1mol/L NaOH溶液作空白對照。

1.2.1.3 樣品含量測定方法 用0.1mol/L NaOH溶解濃縮液，抽濾去除不溶性雜質(zhì)。濾液用0.1mol/L NaOH定容至50mL容量瓶中。取10mL該溶液用0.1mol/L NaOH定容至50mL。取該液1mL，加入1mL顯色劑后，用飽和碳酸鈉定容至10mL。測定該溶液的吸光度A。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得出辣椒堿濃度x，稀釋倍數(shù)為10，則待測液濃度G=10x:

式中:G為待測液濃度，μg/mL;1.065為標(biāo)樣香蘭素?fù)Q算為相當(dāng)量的辣椒堿的系數(shù);W為樣品總克數(shù)，g;106是將g換算為μg。

1.2.2 辣椒堿提取實驗

1.2.2.1 酶法提取工藝 醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，料液（緩沖液）比為1∶5，乙醇浸取時間為2h，初始化值:酶量 7.0mg/g，pH 5.0，溫度 40℃，酶解時間 0.5h。

將辣椒烘干后粉碎，過100目篩，備用。準(zhǔn)確稱取1.0000g 辣椒粉，置于酶量分別為 1、3、5、7、9mg/g的緩沖溶液（pH 分別為 4.4、5.0、5.5、6.0、6.5）中，在30、40、50、60、70℃中分別恒溫保持 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。浸提結(jié)束后將辣椒粉乙醇混合物熱沸滅活10.0min。冷卻至室溫后抽濾。將沖洗殘渣用相應(yīng)濃度的乙醇溶液在錐形瓶中洗滌兩次，抽濾，與先前濾液合并。將上述抽濾液置于燒瓶中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至無酒精味。濃縮液經(jīng)稀釋定容后，進(jìn)行定量測定。

對上述單因素實驗結(jié)果進(jìn)行分析后，設(shè)置正交實驗對酶法提取最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2.2 超聲波提取工藝 準(zhǔn)確稱取1.0000g辣椒粉于錐形瓶中，加入一定量乙醇，濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，改變超聲波功率為 50、60、70、80、90W，提取溫度為 40、50、60、70、77℃，料液比為 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，超聲波處理時間 0.5h，進(jìn)行單因素實驗。將上述溶液進(jìn)行乙醇填補(bǔ)后，在相應(yīng)初始化溫度中用乙醇浸提。冷卻至室溫后抽濾。將沖洗殘渣用相應(yīng)濃度的乙醇溶液在錐形瓶中洗滌兩次，抽濾，與先前濾液合并。將上述抽濾液置于燒瓶中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至無酒精味。濃縮液經(jīng)稀釋定容后，進(jìn)行定量測定。

1.2.2.3 提取方案比較 綜合比較超聲乙醇提取法和纖維素酶法提取辣椒堿的工藝條件及提取率，為生產(chǎn)中工藝方法的選擇提供依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可見，辣椒堿濃度－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:y=0.1552x+0.2596，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，相關(guān)性良好。

圖1 辣椒堿濃度－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of capsaicin

2.2 酶法提取最優(yōu)工藝確定

2.2.1 單因素實驗 由圖2可見，隨著pH的增大，辣椒堿提取率先增大后降低，在pH 5.5時達(dá)到最大，可能在提取pH較大時會引起辣椒堿溶解度的下降，所以導(dǎo)致提取率下降。

圖2 pH對辣椒堿提取率的影響Fig.2 The influence of pH on capsaicin extraction rate

由圖3可見，隨著酶量的增加，提取率一直增加，尤其是酶量在3～7mg/g時，提取率呈線性增加，大于7mg/g時，提取率變化不大，說明底物已呈飽和狀態(tài)，所以最適酶量應(yīng)為7mg/g。

圖3 酶量對辣椒堿提取率的影響Fig.3 The influence of quantity of enzyme on capsaicin extraction rate

由圖4可見，隨著溫度升高，提取率不斷增大，當(dāng)溫度大于55℃時，提取率隨溫度升高呈下降趨勢。可能是在未達(dá)到酶的最適作用溫度前，升高溫度可增加包括酶和底物分子在內(nèi)的溶液體系的熱能，既可使胞內(nèi)活性物質(zhì)分子運動速度加快，有利于其從細(xì)胞內(nèi)向溶液擴(kuò)散，又能提供酶促反應(yīng)所需的能量，使酶解破壁作用加強(qiáng)，所以這時辣椒堿提取得率增大。但是溫度繼續(xù)升高會導(dǎo)致維系著整個酶三維結(jié)構(gòu)的多重弱的非共價鍵相互作用（氫鍵、范德華力等）破裂，使生物酶部分甚至全部變性，酶促反應(yīng)就會被抑制。

表2 方差分析Table 2 The Analysis of variance

圖4 溫度對辣椒堿提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of capsaicin

由圖5可見，隨著酶解時間的延長，提取率不斷增大，當(dāng)酶解時間為1.5h時，提取率達(dá)到最大。主要是由于隨時間的延長，酶活力得到充分的利用，酶解反應(yīng)進(jìn)行的徹底。而當(dāng)達(dá)到最大值以后，時間繼續(xù)延長，辣椒堿產(chǎn)量呈下降趨勢，原因可能是隨著時間的延長，辣椒堿已經(jīng)基本上被提取出來，也可能是時間的延長導(dǎo)致辣椒堿部分分解，反而降低了提取率［5］。

圖5 酶解時間對辣椒堿提取率的影響Fig.5 The influence of enzymolysis timeon capsaicin extraction rate

2.2.2 正交實驗 由單因素實驗結(jié)果，選擇pH、酶量、溫度和酶解時間做L9（34）正交實驗，實驗結(jié)果見表1。

由表1可知，因素的主次順序為pH＞酶解時間＞酶量＞酶解溫度，最優(yōu)水平組合為A2B3C1D1，即在40℃，pH 5.5的條件下，加酶量酶量9mg/g，酶解時間1h，此時的提取率為0.795%。

由表1可求得各列的方差，C項的平方和最小，根據(jù)統(tǒng)計方法中將最小平方和當(dāng)誤差項的算法，因此，C項作為誤差e，而得表2。

由表2可見，pH對辣椒堿的提取影響極顯著，其他因素影響不顯著。

2.3 超聲波乙醇提取最優(yōu)工藝確定

2.3.1 單因素實驗結(jié)果 由圖6～圖9可知，超聲波－乙醇提取最優(yōu)工藝條件為:料液比1∶9，乙醇濃度70%，超聲功率70W，溫度70℃。

表1 正交實驗結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

圖6 料液比對辣椒堿提取的影響Fig.6 The influence of material liquid ratio on capsaicin extraction rate

圖7 乙醇濃度對辣椒堿提取的影響Fig.7 The influence of ethanol concentration on the extraction rate of capsaicin

表4 方差分析Table 4 The Analysis of variance

圖8 超聲功率對辣椒堿提取的影響Fig.8 The influence of ultrasonic power on capsaicin extraction rate

圖9 超聲溫度對辣椒堿提取的影響Fig.9 The influence of ultrasonic temperature on capsaicin extraction rate

2.3.2 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇濃度、超聲功率和處理溫度做L9（34）正交實驗，實驗結(jié)果見表3。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

由表3可知，因素的主次順序為超聲處理溫度＞乙醇濃度＞超聲波功率＞料液比，最優(yōu)水平組合為條件為A3B2C1D2，即超聲處理溫度70℃，乙醇濃度70%，超聲波功率60W，料液比1∶11。此條件下辣椒堿的提取率為1.271%。

由表3可求得各列的方差，C項的平方和最小，根據(jù)統(tǒng)計方法中將最小平方和當(dāng)誤差項的算法，因此，C項作為誤差e，而得表4。

由表4方差分析可知，四因素均無顯著性影響。

2.4 兩種提取方案的比較

a.較纖維素酶提取，超聲波輔助提取由于對設(shè)備要求高、生產(chǎn)成本高等原因，目前僅應(yīng)用于實驗研究中，難適用于大工業(yè)生產(chǎn)。而較超聲波輔助提取，纖維素酶法由于需要較長的催化反應(yīng)時間、較為繁瑣的操作步驟而在緩沖溶液pH、滅酶等方面較難控制。

b.由于對辣椒纖維素組織的破壞作用，纖維素酶能夠加速辣椒堿的釋放，較傳統(tǒng)單一乙醇法提取，高效、節(jié)省溶劑、有效成分損失少，但較為耗時。

c.作為一種物理介質(zhì)彈性波，在超聲波空化作用、熱力學(xué)作用、機(jī)械作用和凝聚作用下，超聲波輔助提取較傳統(tǒng)單一乙醇法提取具有產(chǎn)率高、生產(chǎn)周期短、有效成分損失小的優(yōu)點。

3 結(jié)論

實驗確定了超聲波輔助提取辣椒堿的優(yōu)化工藝條件為超聲處理溫度70℃，乙醇濃度70%，超聲功率60W，料液比1∶11;并對上述四因素影響的顯著性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)均不明顯。確定了酶法提取辣椒堿的優(yōu)化工藝條件為 pH5.5，酶解1h，酶量9mg/g，酶解溫度40℃;并對上述四因素的顯著性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)pH影響十分顯著，其他因素不顯著。生產(chǎn)中若將超聲提取法和酶法聯(lián)用，將會大大提高提取率。

［1］楊威.超聲波提取黃芩藥渣中的黃芩苷［J］.化學(xué)與黏合，2008，11（6）:23－26.

［2］樊鈺虎，易龍，丁偉，等.辣椒中辣椒堿提取工藝條件的研究［J］.西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，24（1）:34－38.

［3］羅倉學(xué)，朱妞，雷學(xué)鋒.纖維素酶法提取辣椒堿的工藝研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，31（11）:12－15.

［4］劉洪升，韓丙軍.分光光度法測定辣椒堿生物農(nóng)藥中辣椒堿總量［J］.現(xiàn)代農(nóng)藥，2008，13（2）:13－17.

［5］A Hiura，H lshizuka.Changes in features of degenerating primary sensory neurons with time after capsaicin treatment［J］.Acta Neuropathol，1989，78（1）:35－46.

Study on the optimum process of two kinds of pre－treatment to extract capsaicin from pepper

ZHANG Bai－gang1，LIU Xiao－feng1，LU Li－ning2
（1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;
2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science Technology，Tianjin 300222，China）

Capsaicin was extracted from pepper respectively by cellulase，ethanol and ultrasonic.The results showed the best condition for extracting capsaicin in enzymatic hydrolysis was:pH 5.5，9mg/g enzyme dosage，1h reaction time and the temperature was 40℃，and the max extraction rate was 0.795%.While the best ultrasonicwave－assisted extraction conditions was 70℃，60W of ultrasonic power，70%of ethanol，ratio of solid －liquid was 1∶11，and the max extraction rate was 1.271%.

capsaicin;cellulose;ultrasonicwave

TS201.1

B

1002－0306（2012）10－0287－04

2011－07－11

張百剛（1981－），男，在讀博士研究生，講師，研究方向:食品生物技術(shù)。