生活飲用水3M PetrifilmTM菌落總數測試片法的不確定度評定

譚和平，葉德萍，沈興中，唐祥凱，王 智

（中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

0 引言

美國3M公司研究生產的PetrifilmTM菌落總數測試片是目前普遍采用的成熟的微生物快速檢測方法，獲得了AOAC官方方法的認可、認證，我國將此方法用于檢測食品中菌落總數，并將其列入出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T 1897-2007）[1]。3M PetrifilmTM菌落總數測試片為預先制備好的平板培養基系統，含有標準的平板計數培養基、冷水可溶性凝膠和特異性的指示劑[2]。目前，國際上統一使用的ISO/IEC 17025:2005《檢測和校準實驗室能力認可準則》中，強調了檢測和校準實驗室在適當時應對測量結果的不確定度進行評定。而當前報道3M PetrifilmTM法檢測菌落總數不確定度評定的文獻較少[3]。為此，該文對3M PetrifilmTM法測定生活飲用水菌落總數的測量結果不確定度進行了評定，以期為從事相關測試和研究的機構及人員提供參考。1 材料及方法

1.1 試劑及材料

0.85%生理鹽水由實驗室自己配制，3M PetrifilmTM菌落總數測試片由3M中國有限公司提供。樣品來源于綿陽、德陽、都江堰等地生活飲用水。

1.2 檢測方法

以無菌操作方法吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶10稀釋液。吸取1∶10的稀釋液1mL注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶100稀釋液。按同法可依次稀釋成 1∶1000，1∶10000 稀釋液等備用。

1.2.2 3M PetrifilmTM菌落總數測試片法[1]

將測試片置于平坦桌面揭開上層膜，吸取1mL適宜稀釋度的稀釋液垂直滴加在測試片中央處，上層膜落下后，用壓板輕輕壓上層膜中央處，使樣液均勻覆蓋于培養面上；拿起壓板，靜置，每個稀釋度接種2張測試片；培養基凝固后置（36±1）℃培養（48±2）h，計數紅色菌落數。

2 不確定度評定

2.1 不確定度來源

3M PetrifilmTM菌落總數測試片檢測生活飲用水中菌落總數不確定度的來源主要包括重復性、逐級稀釋及取樣、培養溫度、培養時間等。

該實驗室培養箱的溫度均勻度為0.6℃，溫度波動度為0℃/30min，溫度偏差為0.5℃。實驗將培養溫度設定為36℃，培養時間為48 h，參照SN/T 1897-2007培養溫度為（36±1）℃，培養時間為（48±2）h，說明溫度和培養時間在規定范圍內波動對菌落生長的影響可忽略。因此，只考慮重復性、逐級稀釋及取樣對菌落總數的影響。

2.2 逐級稀釋及取樣引入的不確定度

實驗過程中分別使用了1mL微量移液器和10mL吸管，移取體積分別為1mL和9mL。1mL微量移液器的容量允許誤差為±1.0%[4]，按均勻分布處理；10mL吸管為A級，容量允許誤差為±0.05 mL[5]，按三角分布處理，則校準相對標準不確定度為

稀釋及取樣不確定度為[6]

陸游《游臥龍寺》一詩描述他追隨夔州的峒民“曉發魚復走瞿唐”，游觀當地人認為最宏大的臥龍寺，結果卻令他十分失望：“過江走馬十五里，小寺殘僧真蕞爾。投鞭入門一為笑，僻陋稱雄有如此?！敝杂X得其寒酸簡陋，是因為陸游見過家鄉所在的吳越地區更為壯觀的寺廟：“君不見天童、徑山金碧浮虛空，千衲梵唄層云中”。故鄉佛教建筑的雄偉，標志著吳越地區經濟、宗教的發達，而夔州，僅從一個小寺廟就可見其各方面的貧窮落后。

式中：x——稀釋及取樣過程中取1mL的次數；

y——稀釋及取樣過程中取9mL的次數。

稀釋10倍所引入的相對標準不確定度為

2.3 重復性引入的不確定度

重復性測量分為單一樣品的重復測量和多個樣品的重復測量兩種情況。由于微生物測量結果的發散性較大，直接根據測量結果計算重復性測量引入的不確定度欠妥，通常將測量結果取對數后再進行計算。該實驗菌落總數檢測結果取對數后，經夏皮羅-威爾克法檢驗為正態分布，可以直接使用A類不確定度計算方法。所以，兩種方法均對測定數據取對數值后再用常規的貝塞爾方法進行計算。

2.3.1 單一樣品重復測量結果的不確定度評定

對某一水源水使用3M PetrifilmTM菌落總數測試片重復測量10次，結果及不確定度的計算過程見表1[7]。

表1 單一樣品重復測量結果不確定度的計算過程

（1）合成標準不確定度。測量結果為10次重復測量的平均值，故平均值的標準不確定度為

（2）擴展不確定度。95%置信概率下取包含因子k=2，則測量結果的擴展不確定度為

2.3.2 多個樣品測量結果的不確定度評定

對多個樣品每個樣品測2次平行的情況可采用合并樣本標準差的方式對測量結果的不確定度進行評定[8]。該文對30個生活飲用水中菌落總數結果不確定度的計算見表2和表3。

（1）標準不確定度。由每個試樣的殘差平方和計算30個樣品的合并樣本標準差，得到

每個試樣測量2次，2次測量的平均值的標準不確定度為

30個樣品中部分樣品是取原液得到的菌落總數，僅取樣引入的不確定度為0.005 8，可以忽略不計。稀釋10倍的樣品在稀釋和取樣過程中引入的不確定度為0.0085，稀釋100倍的樣品在稀釋和取樣過程中引入的不確定度為0.0106，相對于菌落計數測量結果的發散程度引起的不確定度來說，相差數十倍以上，可以忽略不計，因此，只考慮重復測量引入的不確定度。

表2 30個樣品測量結果及不確定度計算過程(未檢出細菌的樣品未列出)

表3 30個樣品不確定度計算過程

（2）擴展不確定度。取置信概率p=95%，自由度ν=m（n-1）=30，由 t分布表可得 k=2.745，于是擴展不確定度為

3 結束語

3M PetrifilmTM菌落總數測試片法測定生活飲用水中菌落總數，其測量不確定度的主要來源由重復性引入，B類不確定度分量對合成不確定度貢獻較小。由于微生物測量結果的發散性較大，一般采用取對數后計算不確定度。對單一樣品重復測量多次的情況，可通過求算數平均值的標準不確定度來求檢測結果的不確定度；對多個樣品每個樣品測平行的情況，可通過求合并樣本標準差求檢測結果的不確定度，而且有了新的檢測結果，還可隨時加入到合并樣本中，重新計算合并樣本標準差，更新其不確定度的取值范圍。

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[4]JJG 646—2006移液器檢定規程[S].北京：中國計量出版社，2006.

[5]JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規程[S].北京：中國計量出版社，2006.

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[7]馬麗輝.葡萄酒中菌落總數測量不確定度的評估研究[J].釀酒，2007，34（5）：83-84.

[8]范媛媛，王樹祥，朱宇旌.食品菌落總數檢驗中不確定度的評估[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（2）：296-297.