人宮頸癌側群細胞的分選及其生物學特性的研究

宋菁華 王克芳 李 斌 張 軍

(首都醫科大學附屬北京安貞醫院婦產科，北京100029)

宮頸癌是發生于全球婦女中僅次于乳腺癌的最常見的惡性腫瘤，全世界每年大約有50萬例新發宮頸癌病例，每年近30萬死亡病例，中晚期患者5年生存率很低［1］。目前宮頸癌病因尚未完全明了，在基礎研究領域，宮頸癌發病的分子機制始終是研究的熱點和難點。近年來，隨著腫瘤干細胞學說［2］的提出，以及越來越多的腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC;或tumour stem cells，TSC)相繼在腫瘤組織中分離成功，為腫瘤研究提供了新的途徑。側群細胞(side population cells)即SP細胞是指一小群可以將脂溶性DNA結合染料(即Hoechst 33342)排出細胞外的細胞，在流式分選的散點圖中，這些細胞處于大多數細胞的一側。研究［3］顯示，SP細胞具有干細胞特性。盡管目前各學科對腫瘤干細胞的研究進行得如火如荼，但在宮頸癌中，無論是針對宮頸癌干細胞的研究還是針對宮頸癌側群細胞的研究，都處在起步階段。本課題立足于腫瘤干細胞學說，擬通過宮頸癌細胞中側群細胞的富集、分離和鑒定，確定其腫瘤干細胞特性，探討以側群細胞作為宮頸癌干細胞研究切入點的可行性，為進一步研究宮頸癌干細胞的靶向治療策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)標本來源:選取2009年12月至2010年12月于首都醫科大學附屬北京安貞醫院婦產科施行宮頸癌手術的病例標本40例(均經患者或委托人知情同意)，其中鱗癌32例、腺癌6例、惡性腺瘤1例、腺鱗癌1例。40例標本中高分化癌5例、中分化癌23例、低分化癌12例。腫瘤均為原發性，術前均未進行放療和化療，所有標本均經北京安貞醫院病理科2名以上有經驗的病理科醫師確診為宮頸癌并按國際婦產科聯盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2009年宮頸癌的臨床分期標準進行分期。所有標本均在手術切除后30min內取材并送實驗室。

2)實驗動物:雌性非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠，4～6周齡，購買并飼養在北京大學醫學院實驗動物科學部［實驗動物合格證號:SCXK(京)2006－0008］。

3)實驗試劑:DMEM/F12 1:1培養基購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液購自Solarbio公司，碘化丙咤(Pl)、維拉帕米(verapamil hydrochloride)、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(MTT)和膠原酶I購自Sigma-Aldrich公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自貝博生物公司。

1.2 實驗方法

1)宮頸癌細胞原代培養及細胞傳代:術中在新鮮腫瘤組織邊緣無壞死、鈣化及電凝部位無菌取材，置于培養基中(DMEM/F12，內含10%FBS)。修剪去除壞死組織及殘余血管，用PBS沖洗3遍，將組織塊剪碎，經0.14%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶-EDTA 37℃分別消化30min，100μm濾網過濾去渣，4℃下1 000 r/min離心10min，棄上清，收集含細胞的沉淀，移至培養瓶中，以含有10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養基在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養48h，洗掉未貼壁細胞繼續培養。從取材到接種在2h內完成。原代培養3～5d時行第1次換液，以后每3～4 d半量換液1次，每7d按1∶2傳代。

2)流式分選:選取處于對數生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，將細胞濃度調整為1×106/mL。向實驗組及對照組細胞懸液中加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/mL，對照組在加入 Hoechst 33342前加拮抗劑維拉帕米至終濃度50μg/mL，避光，于 37℃孵育90min，每隔 15min混勻 1次。4℃1 000 r/min離心10 min，去上清，預冷的PBS洗滌細胞1遍。以含2%FBS的PBS重懸，經40μm濾網過濾后于4℃下存放至檢測。碘化丙啶(PI)染色標記死亡細胞，過流式細胞儀前5min加入PI至終濃度1μg/mL，。將制備好的細胞懸液入流式細胞儀，檢測SP細胞的比例。參數如下:激發波:HOE:UV(351-364)HOE blue:450 HOE red:675 Pl:488nm。為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來的可能誤差，SP細胞的比例取實驗組與對照組之間的差值。在相同波長條件下，對已通過檢測的細胞懸液進行分選，得到宮頸癌側群(SP)細胞和非側群(NSP)細胞亞群。

3)宮頸癌SP和NSP細胞生物學功能鑒定

①細胞生長曲線:將新鮮分離的SP和NSP細胞分別接種于96孔板，1 000個細胞/孔，分別接種32孔，每孔加入200 μL完全培養基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養;24h后，SP和NSP細胞各取4孔，分別加入50mg/mL的MTT 20 μL，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱4h;取出培養板，吸凈培養液及MTT，每孔加入 DMSO 150 μL，搖床震蕩 10min，酶標儀讀OD490值;每24 h測1次OD490值，每次SP和NSP各4孔，連續測8 d，4孔OD490的平均值即為當天細胞的OD值;實驗共重復3次。取3次實驗的平均數繪制生長曲線。

②裸鼠移植瘤試驗:選取4～6周齡NOD/SCID雌性裸鼠32只，采用抽簽法隨機分為8組，每組4只。按照三級動物要求，飼養在25℃恒溫無特定病原體(specific pathogen free，SPF)屏障系統內，12 h光照和12 h黑暗交替，自由進食標準顆粒飼料及飲水。將新鮮分離的SP和NSP細胞離心，PBS重懸，計數，以PBS調整細胞密度為 1×103、1×104、1 ×105、1×106/mL，將不同密度SP和NSP細胞各0.1 mL接種于裸鼠右側背部皮下，每種細胞每個數量級接種4只裸鼠，觀察8周。

③化療藥物敏感性分析:化療藥物選擇順鉑。將新鮮分離的SP和NSP細胞接種至96孔板，1 000個細胞/孔，加入200 μL完全培養基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養;吸凈培養基，分別加入不同終濃度的順鉑(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，每個濃度設3個復孔，其中0濃度為無藥對照，另設3孔只加培養液不加細胞作為調零孔。每孔培養基調整為200μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中繼續培養24 h;從培養箱中取出96孔板，每孔加入已配置好的MTT 20 μL，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中繼續孵育4 h;棄去上清，每孔加入DMSO 150 μL，于振蕩器上振蕩10 min，使其徹底溶解混勻;酶標儀讀OD490值，以只加培養液不加細胞的孔作為調零孔進行調零，取3個復孔的均值為實驗結果。計算細胞增生抑制率:細胞增生抑制率=1－實驗組OD值/無藥對照組OD值;實驗重復3次，取3次抑制率的平均值。

1.3 統計學方法

所有數據分析用SPSS 11.5軟件完成，數據以均數±標準差±s)表示，統計學處理分別采用t檢驗、χ2檢驗、方差分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人宮頸癌細胞形態

光學顯微鏡下，宮頸癌細胞形態符合病理學描述(圖1)，符合本研究需要。

圖1 人宮頸癌細胞Fig.1 Human cervical cancer cells(100×)

2.2 宮頸癌SP細胞流式檢測結果

人宮頸癌細胞染色后去除PI陽性的死細胞，分析狀態良好的活細胞Hoechst 33342熒光染色情況。流式細胞儀可檢測到宮頸癌細胞中SP細胞的存在比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，加入維拉帕米的對照管SP細胞比例下降至0%或接近0%的水平(圖2)。不同分化程度的宮頸癌細胞分別檢測，差異具有統計學意義(P＜0.05)，即在檢測的高、中、低分化的宮頸癌細胞中，SP細胞比例與分化程度有關，分化程度越差者其SP細胞比例越低，詳見表1。

表1 不同分化程度宮頸癌細胞SP比例Tab.1 Proportion of the SP cells with different degree of cervical cancer cells

2.3 細胞生長曲線

MTT法繪制細胞生長曲線，結果顯示:SP細胞與NSP細胞相比生長速度較快，從第3天開始，SP細胞開始大量增生，尤其是第5天起，SP細胞明顯進入指數增長期，而NSP細胞增生緩慢(圖3)。SP細胞和NSP細胞的增生能力差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 裸鼠成瘤效果

實驗結果顯示，SP細胞和NSP細胞的致瘤能力差異有統計學意義(表2)，僅1×103個SP細胞即可形成腫瘤，平均成瘤時間(13.27±2.61)d。而至少1×105個NSP細胞才能形成腫瘤，平均成瘤時間(18.50±1.52)d。相同數量的SP細胞在同一觀察時間點可以形成更大的腫瘤，且形成腫瘤的潛伏期較短。

圖2 人宮頸癌SP細胞流式檢測圖Fig.2 Expressions of cell related markers in human cervical cancer cells as detected by flow cytometry A:Hoechst 33342;B:Hoechst 33342 and verapamil;SP:side population.

圖3 宮頸癌SP和NSP細胞生長曲線Fig.3 Cell growth curve of SP cells and NSP cells

2.5 化療藥物敏感性分析

將SP細胞和NSP細胞分別在不同濃度的化療藥物中作用24h后，應用MTT法檢測細胞存活狀況。結果顯示:化療藥物作用后，SP和NSP細胞均出現一定程度的細胞死亡，但SP細胞表現出較強的耐藥性，只出現少量細胞死亡，而NSP細胞存活明顯減少，細胞增生抑制率顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 宮頸癌SP和NSP細胞裸鼠的成瘤性情況Tab.2 Tumorigenicity of SP cells and NSP cells in nude mice

表3 宮頸癌SP和NSP細胞增生抑制率情況Tab.3 Inhibition rates of SP cells and NSP cells n=9，%

3 討論

腫瘤干細胞是存在于腫瘤中的一小部分具有干細胞性質的細胞群，具有自我更新能力，能夠分化成不同表型的腫瘤細胞，使腫瘤在體內不斷擴大或形成新的腫瘤。除此之外的其他絕大多數腫瘤細胞沒有或僅有有限的增生能力，經短暫的分化增生后即發生凋亡。腫瘤干細胞的分離和鑒定最初來源于血液系統惡性腫瘤，而實體腫瘤細胞較難以分離。目前腫瘤干細胞的分離和培養主要有2種方法，即通過細胞表面特異性標記進行分選和側群(SP)細胞分選法。組織特異性干細胞的嚴格分離鑒定只在少數組織中完成，許多實體組織自身的干細胞表面標志物尚未確定，故限制了此方法的應用。SP細胞作為一個特殊的細胞亞群，其發育和分化狀態可能介于胚胎干細胞和成體干細胞之間，具有很強的多向分化潛能和增生特性，且有較明確的表型標記和分離純化方法，以SP細胞作為切入點來進行宮頸癌干細胞篩選，可望為進一步深入研究宮頸癌干細胞建立基礎。

本研究選用宮頸癌原代培養細胞進行流式分選，為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來的可能誤差，SP細胞的比例取實驗組與對照組之間的差值。結果顯示，宮頸癌細胞中存在一定數量的SP細胞，比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，并可被維拉帕米阻斷，阻斷后 SP細胞比例減少至0～0.60%(0.28%±0.20%)。SP細胞的比例隨分化程度的降低而下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。迄今，有關腫瘤分化程度與SP細胞比例的關系報道較少，且意見不一。Brown M D等［4］研究前列腺腫瘤時發現，腫瘤分化程度越高，其SP細胞比例越高。而Wu C等［5］發現分化不良的間葉源性腫瘤中的SP細胞比例高于分化良好的腫瘤細胞。目前對這一現象仍缺乏公認的解釋，推測出現上述差異的原因可能有:①分化較差的宮頸癌細胞中SP細胞的增生能力和自我更新能力可能更強，故只需較低比例的SP細胞即可維持腫瘤的惡性生物學行為;②分化較差的宮頸癌細胞中NSP細胞的增生能力可能更強，在SP細胞絕對數相似的情況下，NSP細胞的絕對數較大，從而導致其SP細胞的相對比例下降。

作為一個特殊的細胞亞群，SP細胞具備自我更新能力和高致瘤性。Xu J X等［6］研究發現SP細胞的擴增倍數可以達到1 000～5 000倍，而NSP細胞的擴增有時甚至不能達到2倍。為了探討分選出的SP細胞是否具有腫瘤干細胞特性，我們進行了一系列的實驗。采用MTT法檢測SP細胞和NSP細胞的增生能力，發現SP細胞的增生能力顯著強于NSP細胞，2組差異具有統計學意義(P＜0.05)。實驗結果表明，與宮頸癌NSP細胞相比，宮頸癌SP細胞具有更強的增生能力。在腦膠質瘤［7］、神經母細胞瘤［8］、鼻咽癌［9］、乳腺癌［10］、肝癌［11］等多種腫瘤的研究中均有類似發現。但也有學者對這一現象提出質疑，認為NSP細胞在分選后增生較差，可能與分選采用的Hoechst 33342對NSP細胞的毒性作用有關［12］，然而，Hoechst 33342 染料的半衰期較短，且在分裂過程中難以大量傳入子代細胞中而影響其增生［13］，單純以Hoechst 33342染料的毒性作用來解釋上述現象難以令人信服。為了探求宮頸癌SP細胞的致瘤能力，我們采用NOD/SCID小鼠行皮下接種成瘤實驗，把不同數量級的SP和NSP細胞移植到NOD/SCID小鼠皮下，發現SP細胞的成瘤能力明顯強于NSP細胞。

大量臨床和基礎研究［2，7-8］顯示，各種腫瘤對化療藥物的敏感性不一，許多腫瘤經過手術和藥物治療，腫瘤已經幾乎消失，但是，很快又復發了。根據干細胞學說［14］，干細胞一般對化療藥物耐藥，能夠排除化療藥物的毒性，從而成功逃避化療藥物的作用，從而存活下來。雖然大部分腫瘤細胞被殺死了，但是只要腫瘤干細胞還存在，腫瘤就會很容易復發。因此探討腫瘤細胞的耐藥性，尋找腫瘤復發的原因，為腫瘤化療提供新的靶點，具有重要的臨床意義。由于在部分組織中SP細胞表型產生的主要因素是ABCG2/BCRP1的表達，而ABCG2/BCRP1又是主要的耐藥蛋白［15］，故我們推測，SP細胞可能和宮頸癌的化療耐藥相關。我們用MTT法檢測化療藥物順鉑對SP和NSP細胞生長的作用，發現順鉑對NSP細胞的生長抑制明顯，對SP細胞的生長抑制不明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)。這個結果支持SP細胞可能和宮頸癌化療耐藥相關的假設。

本研究應用流式細胞儀分選宮頸癌SP細胞，經各種體內、外鑒定實驗證實，宮頸癌SP細胞具有腫瘤干細胞的生物學特性，生長速度快，自我更新和分化能力強，且具有強大的致瘤性和耐藥性，可作為宮頸癌干細胞研究的切入點，為宮頸癌干細胞的靶向治療深入研究提供了實驗基礎。

［1］豐有吉，沈鏗.婦產科學［M］.北京:人民衛生出版社，2010:316-322.

［2］Reya T，Morrison S J，Clarke M F，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［3］Fong D，Yeh A，Naftalovich R，et al.Curcumin inhibits the side population(SP)phenotype of the rat C6 glioma cell line:towards targeting of cancer stem cells with phytochemicals［J］.Cancer Lett，2010，293(1):65-72.

［4］Brown M D，Gilmore P E，Hart C A，et al.Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side population［J］.Prostate，2007，67(13):1384-1396.

［5］Wu C，Wei Q，Utomo V，et al.Side population cells isola-ted from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential［J］.Cancer Res，2007，67(17):8216-8222.

［6］Xu J X，Morii E，Liu Y，et al.High tolerance to apoptotic stimuli induced by serum depletion and ceramide in sidepopulation cells:high expression of CD55 as a novel character for side-population［J］.Exp Cell Res，2007，313(9):1877-1885.

［7］Kondo T，Setoguchi T，Taga T，et al.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(3):781-786.

［8］Hirschmann-Jax C，Foster A E，Wufl G G，et al.A distinact“side population”of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(39):14228-14333.

［9］Wang J，Guo L P，Chen L Z，et al.Identifieation of Caneer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line［J］.Semin Cancer Res，2007，67(8):3716-3724.

［10］Christgen M，Ballmarier M，Bruchhardt H，et al.Identification of a distinct side population of cancer cells in the Cal-51 human breast carcinoma cell line［J］.Mol Cell Bioehem，2007，306(1):201-212.

［11］張毅，竇科峰，宋文杰，等.MHCC97中邊緣群細胞的成瘤性及其侵襲性觀察［J］.第四軍醫大學學報，2008，29(3):252-254.

［12］Zheng X，Shen G，Yang X，et al.Most C6 cells are cancer stem cells:evidence from clonal and population analyses［J］.Cancer Res，2007，67(8):3691-3697.

［13］Reders R P，Li A，Kaur P.Side population in adult murine epidermis exhibits phenotypic and functional characteristics of keratinocyte stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(35):13168-13173.

［14］Shackleton M.Normal stem cells and cancer stem cells:similar and different［J］.Semin Cancer Biol，2010，20(2):85-92.

［15］Zhou S，Morris J J，Barnes Y，et al.Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population stem cells in mice，and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(19):12339-12344.