一種靈長類動物帕金森病模型行為檢測方法

劉玉軍 魯 強 陳慶友 張進祿

(首都醫科大學北京神經科學研究所，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以中腦黑質多巴胺能神經元變性缺失為主要病理特征的一種神經退行性疾病，臨床表現主要有靜止性震顫、肌強直、運動減少和姿勢反射障礙等［1-2］。PD多在40歲以后發病，隨著老齡化日益加重，其發病率呈現出明顯上升趨勢［3-5］。研究顯示PD發展過程中的行為改變表現出慢性進展的特點，這與多巴胺能神經元發生慢性進行性退變有關［1-7］。目前，有關PD模型實驗大部分來自于嚙齒類低等動物模型，缺乏高等靈長類動物試驗［5-8］，其原因是對高等靈長類動物PD模型行為學變化缺乏客觀有效的評價方法［9-10］。Gash D M等［10］利用計算機模-數轉換技術開發出猴運動檢測平臺(monkey motor assessment panel 2000，mMAP2000)，此方法可以定量檢測及分析人及靈長類動物上肢運動行為，研究結果顯示隨著年齡的增長上肢運動的精確性降低。本課題組將上述技術應用于靈長類(恒河猴)PD動物模型行為學定量檢測，發現本方法受觀察者主觀意見干擾小，是一種科學準確的行為學定量方法。現將本方法實驗過程簡述如下，以供借鑒。

1 實驗儀器設備要求及工作原理

實驗場地要求空間較大、無噪音、無其他人員走動、自然光充足。計算機系統配置要求:CPU2奔騰Ⅲ500 MHz或更高;內存128 MB或更高;硬盤空間1 GB以上可用硬盤空間;操作系統Windows 98、2000或XP［5］。此方法的工作原理為:實驗籠具前方設有取食平臺，在實驗籠具和取食平臺截面分設X和Y兩個取食口，每個取食口安裝監控裝置，當實驗動物取食過程中上肢通過每個取食口時，監控裝置通過光電二極管實現模-數信號轉換，并將數字信號傳輸入電腦，運動監控程序記錄并分析實驗動物運動信息(圖1)。

圖1 猴運動檢測平臺及前臂取食實驗的模式圖Fig.1 A diagram of the mMAP and the animal to set and view the reward in the receptacle chamber during testing

2 PD動物模型的制備

PD動物模型的制備方法同以往研究報道［7］。簡述如下:恒河猴術前禁食禁水24 h，戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉。將耳棒的尖端插入骨性外耳道口，以上頜托將上頜抬起，壓眶板壓住雙側眶下緣最低點確定3個平面垂直。固定后，剃去猴頭頂部毛發，碘酊消毒并鋪巾。以耳間連線前10 mm正中線右側旁開5 mm，作長約3 cm的矢狀切口。將頭皮和骨膜向兩側牽開，用顱骨鉆鉆出一直徑8 mm的骨窗，以尖針刺破硬腦膜。立體定向儀校正0點后，以Hamilton微量進樣器每次抽取20 μL(2.5 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液或同體積0.9%氯化鈉注射液，根據Paxinos恒河猴腦立體定位圖譜確定黑質內兩個靶點注射，第一點坐標為耳間線前10.2 mm，正中線右旁開3.5 mm，硬腦膜下39 mm;第二點坐標為耳間線前8.4 mm，正中線右旁開5.0 mm，硬腦膜下37 mm。每點注射時間為20 min，留針15 min。注射結束后，頭部傷口以3%雙氧水和慶大霉素0.9%氯化鈉注射液沖洗，縫合骨膜和頭皮，放回飼養籠內，慶大霉素1 mg肌肉注射，密切觀察術后動物的體溫、體質量、飲食飲水，排泄情況。

3 上肢活動的檢測

在測試前，對動物進行4～6周的適應訓練，讓其熟悉測試裝置。待動物能夠從猴上肢運動測試儀的平臺上自由抓取食物后，進入正式實驗。該測試裝置是通過多個二極管構成的感應器將上肢經過不同位置的信號記錄并傳輸到計算機后，運行程序分析獲得的數據。測試時將裝置固定于觀察籠的門前，猴通過兩個直徑為8.5 cm的取食口，將放置于平臺上的食物取走(圖2)，該裝置被用于人類和猴上肢活動的定量檢測。實驗檢測左右上肢取食活動，每側各為6次，記錄每次所需時間，取均數為每時間點觀察值，測試均在每日上午10點進行。實驗過程中分別記錄手術前、手術后4周、8周、16周、24周、36周、48周猴前臂取食運動時間和手爪抓取食物所用的時間，分別對右臂和左臂上肢活動術后各時間點與手術前比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖2 前臂取食實驗圖示Fig.2 A photo showing the animal in the receptacle chamber during testing

4 疾病模型行為變化的結果分析

術后動物表現出右側上肢運動無明顯變化，左側上肢運動變得遲緩，手爪抓取食物時出現不穩、吃力、靈活度下降，在術后48周時行為改變更為明顯。

4.1 前臂活動速度的改變

結果顯示，模型動物LPS注射對側上肢(左臂)術后取食時間表現出不同程度的延長，隨時間的推移出現增加的趨勢。在術后24周，注射左側前臂取食時間與術前自身相比分別延長了30.8%;在術后36和48周，注射左側前臂取食時間分別延長了76.5%(P ＜0.01)和50%(P ＜0.01);而注射 LPS的各動物同側肢體(右臂)前臂取食時間各時間點的差異沒有統計學意義(P＞0.05)(圖3)。

圖3 猴前臂運動時間Fig.3 A diagram of monkey’s forearm movement time

4.2 手爪精細活動的改變

注射LPS對側(左側)手爪抓取食物所需時間延長，并出現抓取食物不穩、吃力、抖動，行為改變隨著時間推移而加重。術后24周左側手爪取食時間延長了41.2%;術后36和48周，對側手爪取食時間分別延長了81.8%(P ＜0.01)和 55.6%(P ＜0.01);而各動物在注射LPS后同側(右側)手爪取食時間各時間點差異無統計學意義(圖4)。

圖4 猴手爪取食運動時間Fig.4 A diagram of the monkey’s hand movement times

5 討論

PD為多巴胺神經元進行性丟失，肢體運動障礙進行性加重為臨床表現的神經變性疾病［1-7］。一直以來，PD模型多以嚙齒類模型為主，嚙齒類模型的行為學檢測已經有自主活動計數、游泳實驗、爬桿實驗和懸掛實驗等多種方法［4-6，8］。但對高等動物模型行為學評價多采用評價量表的方法，這種評價方法受觀察者主觀意見干擾影響大，很難對行為變化進行客觀的定量評價［9-10］。本研究顯示mMAP2000系統可以對高等動物模型的大體運動行為活動做定量分析，疾病模型的病程進展過程中，出現上肢不同程度的運動距離減少和運動速度下降等行為學變化，并隨著時間的推移而逐漸加重，呈現進行性呈慢性進展的特點，符合帕金森病慢性進行性加重的疾病進展特點。因此，本文介紹的mMAP2000系統利用計算機模-數轉換技術記錄和定量分析取食過程中上肢運動行為，可有效地去除人為因素的干擾，更加客觀反映動物上肢運動行為的變化，是適用于大型動物(靈長類)PD模型的行為學檢測方法。

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