海參對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制的研究

龍騰騰，王靜鳳，趙 芹，張 珣，李曉林，薛長湖，李兆杰*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

海參對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制的研究

龍騰騰，王靜鳳，趙 芹，張 珣，李曉林，薛長湖，李兆杰*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

目的：研究海參對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠腎臟的保護作用，并探討其作用機制。方法： 采用一次性腹腔注射STZ的方法建立糖尿病大鼠模型，在長期高血糖環境下造成對腎臟的損傷。灌胃海參(800mg/(kg·d)8周后，分別檢測大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數和尿總蛋白、微量白蛋白(mAlb)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)排泄率；采用RT-PCR方法測定大鼠腎臟中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR γ)、轉化生長因子β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF) mRNA的表達水平。結果：海參能顯著降低STZ誘導的糖尿病大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數以及尿總蛋白、mAlb和NAG排泄率(P＜0.05或P＜0.01)，并且能顯著上調糖尿病大鼠PPARγ mRNA，下調TGF-β1和CTGF(P＜0.05) mRNA的表達。結論：海參對糖尿病大鼠具有良好的降血糖及改善腎臟濾過功能的作用，其機制可能與促進腎臟中PPARγmRNA的表達，抑制TGF-β1和CTGF mRNA的表達有關，最終實現對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

糖尿病；日本刺參；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；轉化生長因子β1；結締組織生長因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并發癥之一，已成為糖尿病病人死亡的主要原因。DN的典型病理改變是腎小球硬化，其發病機制目前還不完全清楚。已有研究表明，生長因子如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ)、轉化生長因子β1(transforminggrowth factor beta 1，TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在DN發病機制中起著重要作用，促使細胞外基質(extracelluar material，ECM)蛋白表達增多并抑制其降解[1-2]，而ECM 在腎小球的異常沉積是引起腎小球硬化的主要原因[3]。

海參自古以來被譽為“海產八珍”之一，是世界上少有的高蛋白低脂低膽固醇的營養保健食品，海參中含有海參多糖、海參皂苷、膠原蛋白、腦苷脂、硫酸軟骨素、維生素等多種活性成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、調節血脂、延緩衰老等藥理功能[4-7]。本實驗用海參灌胃鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的糖尿病模型大鼠，研究其對糖尿病大鼠腎臟功能的調節作用，并通過RT-PCR檢測腎臟PPARγ、TGF-β1和CTGF mRNA的表達情況，從分子水平上初步探究海參對腎臟的保護機制，旨在為其合理開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制日本刺參(Apostichopus japonicus)，經超微粉碎后以蒸餾水配制成所需濃度懸濁液備用。

SD雄性大鼠，體質量(200±20)g，SPF級，北京維通利華公司。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 美國Sigma公司；葡萄糖試劑盒 中生北控生物科技有限公司；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-a c e t y l-β-D-glucosaminidase，NAG)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白(microalbuminuria，mAlb)測試盒 上海太陽生物技術公司；PPARγ、TGF-β1、CTGF及β-actin引物 上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

Model680酶標儀 美國Bio-Rad公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；CP100MX離心機日本日立公司；ABI 7500PCR熱循環儀 美國ABI公司；GIS-2008凝膠成像系統 上海天能公司；DYY-6B穩壓穩流電泳儀 北京六一公司；HW.SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京長風公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及動物實驗

SD大鼠適應性喂養5d，隨機取出10只作為正常對照組，其余大鼠禁食不禁水12h，一次性腹腔注射STZ 60mg/kg。STZ臨用前溶解于0.1mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.3)，質量濃度為2g/100mL。正常對照組大鼠按10mL/kg注射相應體積緩沖液。繼續飼養3d后，禁食不禁水5h，尾靜脈采血測空腹血糖值，以血糖值≥16.7mmol/L者為造模成功[8]。

取造模成功的大鼠，按照體質量及血糖值隨機分為模型對照組和海參劑量組，每組10只。劑量組大鼠灌胃海參 800mg/(kg·d)，正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水，灌胃體積為10mL/kg，每天1次，共8周。大鼠于實驗結束前3d，單只入代謝籠收集24h尿液，離心分裝，4℃保存待測；于末次給藥后，大鼠禁食不禁水5h，尾靜脈取血，按照試劑盒方法分離上清，待測血糖水平。處死大鼠，迅速摘取雙腎稱質量，取腎皮質0.1g置于液氮內保存、備用。

1.3.2 空腹血糖和尿糖含量的測定

按照試劑盒說明書測定。

1.3.3 尿總蛋白、mAlb排泄率(UAER)的測定

尿總蛋白含量，采用雙縮脲法測定；尿總蛋白排泄率為尿蛋白含量與24h尿量乘積。mAlb含量，參照試劑盒方法檢測；UAER為mAlb含量與24h尿量乘積。

1.3.4 尿液中NAG排泄率測定

尿液中NAG含量，參照試劑盒方法檢測。NAG排泄率為尿液中NAG含量與24h尿量乘積。

1.3.5 腎肥大指數的測定

1.3.6 腎臟中TGF-β1、CTGF 和PPARγmRNA的表達量測定

采用Trizol試劑提取腎皮質總RNA。采用兩步法RTPCR檢測目的基因的表達量。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性45s，退火30s，72℃延伸45s，循環數次；最后72℃再延伸10min。

表l 引物設計、退火溫度及循環數Table 1 Primers, annealing temperatures and cycle numbers

對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析系統進行光密度掃描分析，以β-actin作為內參校正，用目的基因與β-actin條帶灰度比值代表目的基因的相對表達含量。

1.4 統計學分析

數據分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析。以P＜0.05為具有統計學意義上的差異。實驗結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 海參對空腹血糖和尿糖的影響

表2 海參對大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數以及尿總蛋白、mAlb排泄率的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Apostichopus japonicus on fasting blood glucose,urine glucose, kidney index and the excretion amounts of protein and mAlb in diabetic rats (±s，n=10)

表2 海參對大鼠空腹血糖值、尿糖含量、腎臟指數以及尿總蛋白、mAlb排泄率的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Apostichopus japonicus on fasting blood glucose,urine glucose, kidney index and the excretion amounts of protein and mAlb in diabetic rats (±s，n=10)

注：#.與正常對照組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與正常對照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；*.與模型對照組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型對照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 空腹血糖值/ 24h尿糖值/尿總蛋白排泄率/ UAER/ 腎臟指數(mmol/L) (mmol/L) (mg/24h) (mg/24h) (g/kg)/正常對照組 6.51±0.56 0 10.40±2.75 0.37±0.05 3.84±0.50模型對照組30.02±2.05## 78.32±11.18##34.97±9.15# 0.87±0.05#7.29±0.67#海參組 21.26±3.05** 54.51±6.81** 30.24±6.94 0.70±0.07*6.10±0.78**

如表2所示，模型對照組的空腹血糖和尿糖含量均顯著高于正常對照組(P＜0.01)。經灌胃海參后，二者含量均顯著下降；與模型對照組相比，分別降低了29.18%(P＜0.05)和16.60%(P＜0.01)，表明海參對STZ誘導的糖尿病大鼠的高血糖癥狀具有明顯的改善作用。

2.2 海參對尿總蛋白排泄率、UAER的影響

尿總蛋白及mAlb往往被作為早期糖尿病腎病的診斷指標。由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠的尿總蛋白排泄率和UAER分別提高了236.25%(P＜0.05)和135.14% (P＜0.05)，出現了明顯的糖尿病腎病狀態。與模型對照組相比，海參組尿總蛋白排泄率和UAER分別降低了13.53%和19.54%(P＜0.05)，表明海參能夠降低尿總蛋白的排泄率并顯著抑制尿中mAlb的排出，提示海參對糖尿病腎病大鼠有治療作用。

2.3 海參對腎臟指數的影響

腎臟肥大是糖尿病腎病早期的重要病理特征。由表2可見，與正常對照組相比，模型對照組大鼠的腎臟指數升高了89.84%(P＜0.05)。灌胃海參后腎肥大指數較模型對照組下降了16.32%(P＜0.01)，說明海參可顯著抑制高血糖引起的腎臟肥大。

2.4 對尿液中NAG排泄率的影響

NAG是一種溶酶體酶，其活性增高可作為腎小管細胞損傷的早期標志物[9]。由圖1可見，模型對照組大鼠NAG排泄率較正常對照組增高了2.87倍(P＜0.01)，說明模型大鼠已出現腎小管損傷。經灌胃海參后，海參組NAG排泄率較模型對照組降低了16.10%(P＜0.05)，表明海參對腎小管具有保護作用。

圖1 海參對模型大鼠NAG排泄率的影響(±s，n=10)Fig.1 Effect of Apostichopus japonicus on the excretion amount of NAG in diabetic rats (±s，n=10)

2.5 對大鼠腎臟中TGF-β1、CTGF以及PPARγ mRNA表達量的影響

圖2 海參對糖尿病大鼠 TGF-β1、CTGF以及PPARγmRNA 表達的影響(x－± s，n=10)Fig.2 Effect of Apostichopus japonicus on the expression of TGF-β1,CTGF and PPARγ in diabetic rats (±s，n=10)

由圖2可見，模型對照組大鼠腎臟中TGF-β1和CTGF mRNA 表達均顯著升高(P＜0.01)，灌胃海參樣品后，二者表達量均顯著降低，與模型對照組相比，分別下降了24.39%(P＜0.05)和6.3%(P＜0.05)。與此同時，模型對照組PPARγmRNA表達量明顯下降(P＜0.01)，經灌胃海參后，PPARγmRNA表達量較模型對照組顯著提高了77.99%(P＜0.05)。

3 討 論

糖尿病所致腎損傷是糖尿病嚴重的并發癥之一，是糖尿病致殘致死的重要原因，其病理學特征主要是腎臟體積增大，細胞外基質積聚，腎小球濾過率增加和蛋白尿[10]。高血糖是糖尿病、腎病的啟動因素，也是DN發生和發展的基本因素，其可通過多種途徑損害腎臟[11-12]，因此，控制血糖是防治DN的關鍵。mAlb是反映腎小球濾過功能的主要指標，在正常情況下，mAlb很難通過腎小球基底膜，當糖尿病腎病發生后由于腎小球濾過膜電荷的丟失，尤其是基底膜孔徑的改變，導致了mAlb的排出。NAG是來自腎近曲小管溶酶體內的酸性水解酶，是反映腎小管功能的靈敏指標[13]。蛋白尿不僅反映腎小球損傷，而且對腎小球系膜有毒性作用，損害腎小管間質等[14-15]。本實驗通過檢測STZ誘導的糖尿病大鼠的空腹血糖值、腎臟指數和尿總蛋白、mAlb、NAG的排泄率，綜合評價了其腎損害的程度，結果表明，海參給藥8周，可明顯降低糖尿病大鼠空腹血糖值、尿糖值和腎臟指數，有效抑制尿總蛋白、mAlb和NAG的排泄率，增強腎皮質中PPARγmRNA的表達，降低腎皮質中TGF-β1、CTGF mRNA的表達。

近年來的研究發現，細胞因子的改變與DN的發病和細胞外基質成分的合成及代謝密切相關[16-17]。TGF-β是一種多功能的肽類物質，由多種細胞分泌的具有多重生物學效應的細胞因子，主要存在3種異構體，其中腎臟中以TGF-β1為主。TGF-β1是致腎小球硬化最強的細胞因子，主要由腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞分泌，通過自分泌與旁分泌途徑，誘導腎小球及ECM積聚，加速 DN 的形成[18]。人體研究表明，DN時腎小球和腎小管間質部TGF-β1表達水平均升高[19]。本實驗研究結果顯示，海參能顯著抑制糖尿病模型大鼠腎臟中TGF-β1mRNA的表達(P＜0.05)，說明抑制TGF-β1的表達是海參保護糖尿病大鼠腎臟的有效途徑之一。

CTGF是一種富含半胱氨酸的生長調節因子，在腎臟中含量最豐富。在體外細胞培養實驗中，應用特異性抗CTGF抗體或CTGF反義寡核苷酸探針，可有效抑制TGF-β誘導的成纖維細胞增生和膠原合成，這提示了CTGF作為TGF-β的下游調節因子, 介導和增強了TGF-β1的促膠原合成與致腎小球硬化作用[20]。Wang Shinong等[2]也認為，TGF-β是誘導糖尿病腎病大鼠近曲小管上皮細胞產生CTGF增多的主要原因，而CTGF作用于間質成纖維細胞，使ECM過量合成而沉積，最終導致糖尿病腎病大鼠腎間質纖維化的發生。本實驗結果顯示，海參可顯著抑制DN大鼠腎臟中CTGF mRNA表達，進而抑制其腎臟纖維化的進程，起到保護腎臟的作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的核轉錄因子超家族，分為3種亞型，其中PPAR γ被認為是一種新的治療腎臟疾病的靶點，其與TGF-β1和CTGF關系密切[21-22]。盧穎[23]認為，PPARγ活化可抑制TGF-β1及腎間質成纖維細胞激活，使CTGF表達和細胞外基質合成減少。Zeng等[24]也報道，PPARγ激動劑能延緩和減輕STZ誘導的糖尿病模型大鼠蛋白尿的發生和程度，減少腎小球細胞外基質的儲積，下調TGF-β1的表達，與本實驗結果一致，表明海參可激活PPARγ，繼而調控下游的細胞因子，具有直接、有益的腎臟保護作用。

綜上所述，海參對STZ誘導的糖尿病大鼠具有顯著的降血糖及腎臟保護作用，其作用機制可能是海參中含有的多糖、皂苷、膠原蛋白和腦苷脂等活性成分通過激活PPARγ，抑制TGF-β1活性的發揮，下調CTGF的表達，從而減少ECM的積聚，抑制腎小球肥大，阻斷和減輕腎臟微細血管病變，提高腎小球的濾過率，緩解腎小球硬化，以此實現對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

[1] MIZUNO S, MATSUMOTO K, KUROSAWA T, et al. Reciprocal balance of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-β1in renal fibrosis in mice[J]. Kidney Int, 2000, 57(3): 937-948.

[2] WANG Shinong, DENICHILO M, BRUBAKER C, et al. Connective tissue growth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2001, 60(1): 96-105.

[3] 李興, 張木勛. HGF對糖尿病腎病TGF-β1mRNA表達的影響[J].山西醫科大學學報, 2006, 37(7): 703-706.

[4] 趙芹, 王靜鳳, 薛勇, 等. 三種海參的主要活性成分和免疫調節作用的比較研究[J]. 中國水產科學, 2008, 15(1): 154-159.

[5] 高森, 王靜鳳, 王玉明, 等. 冰島刺參調節血脂及其作用機制[J]. 武漢大學學報, 2009, 55(3): 324-328.

[6] AMININ D L, PINEGIN B V, PICHUGINA L V, et al. Immunomodulatory properties of Cumaside[J]. Int Immunopharmacology, 2006, 6(7): 1070-1082.

[7] 胡曉倩, 王玉明, 任兵興, 等. 海參主要活性成分對大鼠脂質代謝影響的比較研究[J]. 食品科學, 2009, 30(23): 393-396.

[8] 王靜鳳, 李曉林, 張珣, 等. 海參蟲草復劑對糖尿病大鼠腎臟保護作用機制的研究[J]. 中國藥理學通報, 2010, 26(9): 1238-1242

[9] 歐陽涓, 姜儻. 腎臟的損傷性診斷[J]. 中華檢驗醫學雜志, 2005, 28(8): 877.

[10] LEEHEY D J, SINGH A K, ALAVI N, et al. Role of angiotensin Ⅱin diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2000, 77: 93-98.

[11] 房輝, 徐剛, 于德民, 等. TGF-β1和 ECM 與糖尿病腎病關系的實驗研究[J]. 中國糖尿病雜志, 2000, 8(4): 227- 230.

[12] 陳秋. IV 型膠原與糖尿病腎病[J] . 國外醫學: 內分泌學分冊, 1998,18(4): 206-209.

[13] 葉任高, 許韓師. 尿溶菌酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶測定對腎小管-間質病變的診斷價值[J]. 中國實用內科雜志, 1999, 19(4): 198.

[14] REMUZZI G, RUGGENENTI P, BENIGNI A. Understanding the nature of renal disease progerssion[J]. Kidney Int, 1997, 51: 2-15.

[15] BURTON C J, HARPER S J, BAILEY E, et al. Turnover of human tubular cells exposed to proteinsin vivoandin vitro[J]. Kidney Int,2001, 59: 507-514.

[16] AKAHORI H, OTA T, TORITA M, et al. Tranilast prevents the progression of experimental diabetic nephropathy through suppression of enhanced extracellular matrix gene expression[J]. J Pharmacol Exp Ther,2005, 314(2): 514-521.

[17] CHEN S, HONG S W, LGLESIAS-de la CRUZ M C, et al. The key role of the transforming growth factor beta system in the pathogenes is of diabetic nephropathy[J]. Renal Failure, 2001, 23: 471-481.

[18] ZIYADEH F N. Mediators of diabetic renal disease: the case for TGF-beta as the major mediator[J]. J Am Soc Nephrol, 2004, 15: 55-57.

[19] IWANO M, KUBO A, NISHINO T, et al. Quantification of glomerular TGF-β1mRNA in patients with diabetes mellitus[J]. Kidney Int, 1996,49: 1120 -1126.

[20] 宋恩峰, 劉蒙, 賈汝漢, 等. 厄貝沙坦對糖尿病腎病模型大鼠結締組織生長因子的影響[J]. 醫藥導報, 2008, 7(8): 902-904.

[21] 劉輝, 于曉艷, 魏海峰, 等. PPAR γ激活對糖基化終末產物引起的大鼠腎系膜細胞TGF-β1及CTGF mRNA表達的影響[J]. 中國老年學雜志, 2010, 30(4): 1062-1064.

[22] WANG Weiming, LIU Feng, CHEN Nan. Peroxisome proliferator activated receptor-γ agonist the profibrotic response induced by TGF-β1in renal interstitial fibroblasts[J]. Mediators Inflamm, 2007, 10(7): 134-140.

[23] 盧穎. 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ與腎臟纖維化的研究進展[J]. 上海交通大學學報: 醫學版, 2010, 30(1): 104-107.

[24] ZENG F, FOMONI A, ELLIOT S J, et al. Upregulation of typeⅠcollagen by TGF-β in mesangial cells is blocked by PPARγ activation[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2002, 282(4): 639-648.

Protective Effect and Mechanism ofApostichopus japonicuson Kidney of Diabetic Rats

LONG Teng-teng，WANG Jing-feng，ZHAO Qin，ZHANG Xun，LI Xiao-lin，XUE Chang-hu，LI Zhao-jie*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To explore the protective effect ofApostichopus japonicuson the kidney of streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats and its possible mechanisms. Methods: A diabetic rat model was developed by a single intraperitoneal injection of STZ at the dose of 60 mg/kg and kidney damage was induced by long-term high levels of blood glucose. The diabetic rats were administered withApostichopus japonicusat the daily dose of 800 mg/kg for 8 consecutive weeks. The changes in fasting blood glucose, urine glucose, renal index, and the excretion amounts of urine protein, mAlb and NAG were determined. The mRNA expression of peroxisome proliferation activated receptor-γ (PPAR γ), transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in kidney were assessed by RT-PCR. Results:Apostichopus japonicusshowed remarkable a suppressive effect on fasting blood glucose, uric glucose, kidney index and the excretion amounts of protein, mAlb and NAG in diabetic rats. The expression level of PPARγ mRNA was markedly increased, while the mRNA expression levels of TGF-β1 and CTGF were effectively suppressed byApostichopus japonicus. Conclusion:Apostichopus japonicuscan remarkably reduce blood glucose through improving the expression of PPAR γ and restraining the expression of TGF-β1 and CTGF, which results in a protective effect on kidney damage.

diabetes；Apostichopus japonicus；PPARγ；TGF-β1；CTGF

R322.6；R587.1

A

1002-6630(2012)01-0252-05

2011-03-11

國家海洋局海洋公益性行業科研專項(201105029)；國際科技合作項目(2010DFA31330)

龍騰騰(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為海洋生物活性物質。E-mail：kenanlong@126.com

*通信作者：李兆杰(1970— )，男，高級工程師，研究方向為水產品加工。E-mail：lizhaojie@ouc.edu.cn