一株致病性奇異變形桿菌的分離與鑒定

曲信芹 穆曉惠 李甜甜

（揚州大學獸醫學院 江蘇 揚州 225009）

變形桿菌（proteusbacillus vulgaris）是人和動物的寄生菌和病原菌。廣泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐敗有機物及人或動物的腸道內。變形桿菌屬于腸桿菌科，包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、莫根變形桿菌、雷極變形桿菌和無恒變形桿菌[1]。變形桿菌呈明顯的多形性，有球形和絲狀形，為周鞭毛菌，運動活潑。有菌毛，可粘附于植物和真菌細菌表面，但不吸附動物組織細胞和紅細胞。變形桿菌為條件致病菌，多為繼發感染，當機體抵抗力下降時，可引起人及動物的創傷感染、膀胱炎、尿道炎、敗血癥、食物中毒等，一般健康人群帶菌率為1.3%～10.4%[2]。奇異變形桿菌引起的感染有日益增長的趨勢，在美國，醫院內感染率約為3%[3]。因此，快速準確地做出診斷，對致病性變形桿菌的防控有重要的意義。本試驗采用傳統的病原學方法及16S rDNA測序技術結合起來進行菌株的鑒定，從臨床采集的病料中分離出一株致病性奇異變形桿菌。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

病料來自于江蘇某規模化豬場，無菌取某豬的肺臟、肺門淋巴結作為待檢材料。

1.2 培養基

試驗所用培養基為普通營養瓊脂平板、普通營養肉湯、麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板等按常規方法配制。

1.3 細菌學鑒定

1.3.1 細菌的分離培養 將無菌采集的病豬肺及肺門淋巴結分別接種于普通營養瓊脂平板上，分別在有氧和厭氧條件下37℃培養24h，挑去優勢菌落再分別接種于以上四種培養基直至得到菌落形態和鏡檢菌體形態一致的純培養物。

1.3.2 細菌形態觀察 將純培養物按常規方法[4]進行革蘭氏染色、顯微鏡觀察。

1.3.3 生化鑒定 將培養24h的菌液按常量接種于生化微量鑒定管內，37℃培養，觀察并記錄結果。

1.3.4 藥敏試驗 采用標準的抗生素紙片法[5]，按2003年美國NCCLS（美國國立臨床實驗室標準化委員會）藥敏試驗法規進行。

1.3.5 16SrDNA的擴增及序列測定 從平板上挑取少許單菌落，移入LB液體培養基擴大培養，取1ml新鮮菌液，離心收集菌體，用超純水重懸，煮沸冰浴后離心，其上清即為細菌的DNA。然后按照PCR擴增細菌16SrDNA的試劑盒（購自Takara公司）將該菌的16SrDNA前500bp進行PCR擴增，16SrDNA的前500 bp序列變化較大，包含有豐富的細菌種屬的特異性信息，進行DNA測序時一個測序反應即可測通，是一種較為經濟便捷的16SrDNA鑒定方法。反應產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，鑒定正確后根據膠回收試劑盒的操作說明進行純化，然后送上海生工測序。

2 結果與分析

2.1 細菌的培養特性

該分離菌在有氧和厭氧條件下均能生長，打開平皿時具有腐敗氣味。在普通營養瓊脂平板上和血瓊脂平板上，菌落呈圓形，半透明的呈薄膜擴散狀生長，對光觀察，菌落周圍呈淡藍色，血平板上不產生溶血；在麥康凱上長出均勻圓形、扁平、半透明的單個無色菌落；在普通營養肉湯中，培養基混濁液面可見菌膜，管底有少量沉淀。

2.2 細菌形態

經革蘭氏染色后鏡檢可觀察到，該分離菌為革蘭氏陰性，兩端鈍圓，呈單個或成對的球狀、球桿狀、長絲狀等多形態的桿菌。

2.3 生化特性

表1 分離菌的生化反應結果

2.4 藥物敏感試驗

分離菌對慶大霉素，新霉素，四環素，氯霉素，卡那霉素，鏈霉素，氨芐霉素等多種抗生素均不敏感，僅對阿米卡星敏感，顯示多重耐藥性。

根據以上該菌的形態，培養和生化特性及藥敏試驗結果，可初步判定該菌為奇異變形桿菌。

2.5 16SrDNA擴增結果及序列分析

圖1 分離菌16SrDNA前500bpPCR擴增的結果1為陰性對照；2為該分離菌；3為100bpDNA Ladder Maker。

將這株菌的16SrDNA序列測定結果提交到GenBank，與GenBank中相關序列的BLAST比較，結果表明與奇異變形桿菌菌種的同源性高達99%。可判定此分離菌株為奇異變形桿菌。

3 討論

奇異變形桿菌廣泛分布于自然界可以通過消化道、呼吸道等途徑傳播，近年來不斷有豬群爆發流行奇異變形桿菌的報道，該病已成為危害我國養豬業的一種新的細菌性傳染病。并且還可引起人類的原發性或繼發性感染，造成人類食物中毒，其作為人畜共患傳染病病原，應引起高度重視。細菌培養是臨床鑒定細菌的傳統方法，而本試驗應用傳統方法和16SrDNA序列分析檢測奇異變形桿菌相結合的技術，更加快速、簡便，為該病的診斷提供了有效的途徑。疫病的發生與機體的抵抗力密切相關，預防該病的關鍵是加強豬群的飼養管理，增強機體的防御能力。