一種新型補充礦物元素的載體
——脫鐵鐵蛋白的研究進展

王 震，冷小京*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

一種新型補充礦物元素的載體
——脫鐵鐵蛋白的研究進展

王 震，冷小京*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

鐵蛋白(ferritin)經脫鐵處理后，內部空腔可裝載多種礦物元素。鑒于這種蛋白可經胞飲作用，完整地被小腸上皮細胞吸收，因此有望作為新型礦物元素載體而發展。脫鐵鐵蛋白(apoferritin)的脫鐵及礦物元素的裝載過程可利用透射電鏡(TEM)、能譜分析(EDS)、X射線粉末衍射(X-Ray)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)、動態光散射(DLS)、紫外分光光度法(UV)等技術研究分析。本文綜述了目前國內外利用鐵蛋白裝載礦物元素的成果及其在營養方面的應用。

鐵蛋白；脫鐵鐵蛋白；礦物元素；載體

礦物元素與人的生命和健康息息相關，如作為酶的組分起催化作用，參與激素作用調節生物功能，影響核酸的代謝，影響生物物理效應等[1]；其攝入過量或不足都會不同程度地引發人體生理代謝異常或導致疾病。人體所需的礦物元素涉及多種過渡族元素，如F e、Cu、Zn、Co、Mn、Ni等，這些元素極易發生中和、沉淀、或絡合等反應，而C a、Z n、C u、M g、F e等金屬離子也易與磷酸根、蛋白質形成低溶解度的絡合物，從而影響礦物質元素的人體吸收利用率[2]。解決上述問題的傳統方法是通過化學手段，促使礦物元素與特定有機成分反應形成配合物來增加溶解度，提高可利用性。利用脫鐵鐵蛋白(apoferritin)的空腔制備新型生物納米運載體系，通過胞吞作用被人體吸收，是一種全新的生物技術，因此引起國內外相關領域極大關注。

鐵蛋白最初發現于脊椎動物的肝臟、脾臟等器官中，后確認這是種廣泛存在于動物及植物等幾乎所有生命體中的一類鐵儲藏蛋白，它的功能主要是儲藏和隔離鐵，調節鐵離子的代謝。鐵蛋白可以結合許多金屬離子[3]，而且是第一個被用作模板合成金屬顆粒的蛋白質[4]。天然鐵蛋白是一種良好的補鐵試劑，在補鐵實驗中發現其對人體無毒害作用[5]。鐵蛋白結合到腸細胞表面受體后，通過胞吞作用可完整的轉運到細胞內部利用。將鐵蛋白內部的鐵核在無氧環境下通過還原反應除去得到Apoferritin，之后使用化學方法將其他礦物質離子加入Apoferritin體系，可形成新型生物納米顆粒。礦物質進入脫鐵鐵蛋白的過程可使用電鏡、能譜分析、粉末衍射、質譜、核磁共振、動態光散射、紫外分光光度法等方法研究。

1 鐵蛋白的結構與功能

1.1 鐵蛋白的結構特點

鐵蛋白是由24個亞基組成的類球狀蛋白分子，內徑約為8nm，外徑約12nm。鐵蛋白的亞基主要包括兩種類型：重鏈(H)和輕鏈(L)，每個亞基包括 5個α螺旋，即從N端起形成4個α螺旋(A、B、C、D)，C末端由第5個較短α螺旋(E)構成[6-7]；24個亞基構成一個呈432點對稱的菱形十二面體蛋白質外殼。在該十二面體上沿二、三、四重旋轉軸分別可得由亞基組成的12個2倍軸通道，8個3倍軸通道和6個4倍軸通道(圖1)，負責鐵蛋白內外物質的交換[8]。在植物鐵蛋白中，3倍軸和4倍軸通道都是親水性的，而在動物鐵蛋白中，3倍軸通道由親水性殘基組成，4倍軸通道由疏水性殘基組成[9]。

圖1 鐵蛋白的結構Fig.1 Microstructure of ferritin

1.2 鐵蛋白的功能特性

當細胞內Fe2＋濃度高時，鐵蛋白催化Fe2＋被氧氣分子氧化，并把生成的Fe3＋儲藏于其內部空腔，1分子鐵蛋白最多可儲存4500個Fe3＋。當細胞需要鐵時，即Fe2＋濃度低時，鐵蛋白在還原劑的幫助下將Fe3＋還原為Fe2＋，將鐵從其內部釋放出來供其他代謝所利用。因此，鐵蛋白在細胞內具有去除Fe2＋的毒性以及調節鐵代謝平衡的雙重作用[8]。

1.3 鐵蛋白的金屬離子結合位點

鐵蛋白通道及空腔內部有許多帶負電的氨基酸殘基都可結合金屬離子，如人體鐵蛋白H鏈上組成通道中親水區域的Glu 27、Glu61、Glu 62、Glu 107和Gln 141和馬脾鐵蛋白的L鏈中指向內部空腔的Glu 60、Glu 61[10]等；其他帶負電的氨基酸殘基如Asp也可通過靜電作用結合金屬離子。鐵蛋白通道中負電氨基酸殘基可構成電勢梯度，金屬離子可順著電勢轉運到鐵蛋白內部[11]。

2 鐵蛋白裝載的礦物元素

2.1 礦物離子的種類

鐵蛋白內部可結合多種金屬離子如Fe2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Pt2+等[3]。鐵蛋白的鐵核可利用Apoferritin在體外合成[12]，且大小分布均一，為(7.3±1.4)nm，與天然鐵核相似。目前已合成的金屬納米顆粒有：ZnSe[13]、Mn(O)OH和Mn3O4[14]、Co(O)OH和Co3O4[15]、Cr(OH)3、Ni(OH)3[16]、Eu(O)OH、In2O3、TiO2[17]、FeS、CdS[18]、CdSe[19]等。鐵蛋白的礦化成核作用不具有專一性，說明導致金屬陽離子進入空腔內部的主要起因是靜電作用。在ZnSe的合成中，Zn2+需先于Se2-加入與Apoferritin反應，也可通過蛋白質的靜電導向作用來描述。Apoferritin內表面負電殘基首先結合帶正電的Zn2+，然后陰離子Se2-進入鐵蛋白內部再與Zn2+結合。借助Apoferritin內部金屬離子還原的方法，還可進一步合成金屬單質顆粒[13]等。

2.2 礦物核心的形成

鐵蛋白的3倍軸、4倍軸通道直徑為0.3～0.4nm，金屬離子通過擴散作用可進入Apoferritin內部，結合到帶負電的氨基酸殘基位點，然后通過一定作用成晶核，逐漸長大至粒徑大小約為8nm——即鐵蛋白內徑。金屬納米顆粒的形成可分兩種類型(圖2)。

圖2 Apoferritin 內合成的金屬納米顆粒Fig.2 Synthesis of metal nanoparticles in apoferritin

類型一：金屬離子在鐵蛋白內部沉淀成核，如Wong等[18]合成CdS的方法 (圖2A)：在氮氣環境中，向1mg/mL Apoferritin加入Cd2+(Cd2+與Apoferritin物質的量比為55)，1h后加入HS－(HS－與Cd2+物質的量比為2.5)反應45min，再加入HS－(HS－與Cd2+物質的量比為2.5)反應45～60min，最后在緩沖液中(pH 7.5的TES/ NaCl)透析除去游離的Cd2+或HS－。重復此過程，使CdS 顆粒在Apoferritin 空腔內長大。

類型二：金屬離子在鐵蛋白內部通過氧化還原反應成核，如Galvez 等[20]合成Cu的方法 (圖2B)：向0.1mL CuSO4(0.1mol/L)溶液中加入4mL Apoferritin(40μmol/L) ，使Cu與Apoferritin 的物質的量比達到2000。Apoferritin與Cu2+復合物通過分子篩層析色譜柱(G-25 Sephadex)分離純化，然后向溶液中加入還原劑NaBH4，將Apoferritin內的Cu2+還原為銅單質。體系在4℃條件下反應24h，pH值穩定在8左右。

使用脫鐵鐵蛋白合成金屬納米顆粒的過程需要控制pH值、溫度等條件。與Apoferritin結合的金屬離子數量受pH值的影響。如Pead等[3]研究發現，在pH7.5時，每個Apoferritin分子可結合Cd2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+的數量分別為54、33、30、16，而在pH5.5時結合的數量分別為3、29、1.5、1。由此可見，pH值的升高可增加Apoferritin所帶負電荷量，增強靜電吸引作用，結合更多的金屬離子。鐵蛋白的結構變化，如亞基的解離，也會受pH值的影響，因此為保證鐵蛋白的穩定性，研究中需要將pH值控制在適當范圍內。這一特性也可用于礦物元素的裝載。利用pH2.0時鐵蛋白亞基解離，pH7.5時亞基可重新聚集的特性來裝載鉑金屬[21-22]。金屬離子與鐵蛋白的結合在低溫下反應平衡時間增長，高溫時變短。溫度的提高有助于小分子進入鐵蛋白的擴散以及聚集效果。在20～40℃之間，硝基氧分子進入馬脾鐵蛋白的速率每升高10℃可增加一倍。

2.3 礦物離子及納米顆粒的研究方法

分子篩層析色譜法分離純化、紫外分光及原子吸收法的聯用，經常用于判斷蛋白質與金屬離子的結合。在含Ag的Apoferritin的洗脫曲線中存在兩個原子吸收峰[18,20]，Galvez 等[20]認為，第一個峰與蛋白質在280nm處的吸收峰同時出現，表明Apoferritin與Ag的結合，而第二個峰表示未與蛋白質結合的游離Ag。而通過純Apoferritin與載有金屬的Apoferritin天然聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶的比較，可驗證裝載金屬離子后的Apoferritin的分子是否依舊完整[21]，兩者條帶相同表示裝載金屬離子的鐵蛋白結構沒有改變。

透射電鏡(TEM)是研究鐵蛋白合成納米顆粒的直觀手段，將濃度0.1μmol/L的鐵蛋白溶液滴于鍍有碳膜的銅網或金網上，用醋酸鈾酰或硫金代葡糖糖染色，在室溫下干燥后即可觀測[20]。Yamashita等[23]利用它觀測礦化核及負染色后的鐵蛋白殼，從而證明礦化核是在鐵蛋白內部形成的。如圖3(比例尺為30nm)，黑色圓點是金屬礦化核，環繞周圍的是鐵蛋白殼。染色劑硫金代葡萄糖分子質量較大，無法通過鐵蛋白殼上的通道進入內部，因此可用來研究蛋白殼內核的形成。對于粒徑分布均勻的類球形鐵蛋白，使用TEM可直接測量顆粒的真實粒徑[20]。Kim等[24]使用電鏡研究Co3O4、CoOOH納米顆粒的形成，觀測到Co首先形成有空腔的礦化核，然后礦化核變為實心的球體。需要注意的是，當Apoferritin內的金屬離子濃度過低，導致樣品電子密度過低時，圖像分辨率會受到很大影響。在Wong等[18]合成CdS過程中，若Cd2+與Apoferritin物質的量比低于110時，顆粒為灰白色，觀測不到礦物質內核。

圖3 鐵蛋白內Fe、Co、Ni氧化物的透射電鏡照片Fig.3 Transmission electron micrographs of iron oxide, cobalt oxide and nickel oxide in ferritin

Galvez 等[25]將EDS能譜分析技術與TEM聯用，檢測納米顆粒的成分及含量，如通過檢測蛋白殼內外Co的含量，可證明合成的金屬Co核存在于蛋白殼內部。Tosha 等[26]利用X射線粉末衍射(X-Ray)技術，可分辨納米顆粒的晶體構造。Wong等[18]利用核磁共振法(NMR)監測了Fe2＋與Apoferritin的結合，以及鐵氧化物在蛋白空腔內部形成的過程。他們發現，1個Apoferritin首先結合12個Fe2＋，然后才在其內部形成Fe2O3沉淀，進而形成Fe2O3核。Li Chaorui等[27]利用動態光散射技術(DLS)在水環境下測定納米顆粒的水合粒徑，以及反應裝載金屬離子后鐵蛋白大小的變化及聚集等特征。

3 載有礦物元素的鐵蛋白的應用

4 展 望

人體需要多種礦物元素，以保持正常的生命活動，但它們的吸收利用受諸多因素影響，如沉淀、螯合等。鐵蛋白作為一種新型生物納米載體可裝載許多礦物營養因子，并保持它們的功能活性。鐵蛋白可溶，易吸收，其能夠保護礦物元素免受外界不良影響，完整地轉運到小腸上皮細胞內等特性，可有效增加礦物元素的生物利用率。不過，有關使用改性技術制備的鐵蛋白載體毒理方面的研究尚不充分，有待繼續探討。目前，有關鐵蛋白裝載金屬離子的研究越來越廣泛，隨著對鐵蛋白裝載金屬離子機制以及被人體利用途徑研究的深入，鐵蛋白運載將成為一種具有獨特功效的補充礦物元素的技術。

[1]王林, 章敏, 胡秋. 刺槐花營養功能成分及其開發利用[J]. 食品科學, 2006, 27(2): 274-276.

[2]黃漢軍, 賈振軍, 穆曉梅, 等. 影響飼料中礦物元素吸收利用的因素[J]. 畜牧獸醫雜志, 2002, 21(5):16-20.

[3]PEAD S, DURRANT E, WEBB B, et al. Metal ion binding to apo, holo, and reconstituted horse spleen ferritin[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 1995, 59(1): 15-27.

[4]UCHIDA M, KLEM M T, ALLEN M, et al. Biological containers: protein cages as multifunctional nanoplatforms[J]. Advanced Materials, 2007, 19(8): 1025-1042.

[5]ZHAO Guanghua. Phytoferritin and its implications for human health and nutrition[J]. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 2010, 1800(8): 815-823.

[6]MASUDA T, GOTO F, YOSHIHARA T A. Novel plant ferritin subunit from soybean that is related to a mechanism in iron release[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(22): 19575-19579.

[7]HARRISON P M, AROSIO P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1996, 1275(3): 161-203.

[8]CHASTEEN N D, HARRISON P M. Mineralization in ferritin: an efficient means of iron storage[J]. Journal of Structural Biology, 1999, 126(3): 182-194.

[9]BRIAT J F, RAVET K, ARNAUD N, et al. New insights into ferritin synthesis and function highlight a link between iron homeostasis and oxidative stress in plants[J]. Annals of Botany, 2010, 105(5): 811-822.

[10]LAWSON D M, ARTYMIUK P J, YEWDALL S J, et al. Solving the structure of human H ferritin by genetically engineering intermolecular crystal contacts[J]. Nature, 1991, 349: 541-544.

[11]WATT G D, JACOBS D, FRANKEL R B. Redox reactivity of bacterial and mammalian ferritin: is reductant entry into the ferritin interior a necessary step for iron release[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1988, 85(20): 7457-7461.

[12]UCHIDA M, KANG S, REICHHARDT C, et al. The ferritin superfamily: supramolecular templates for materials synthesis[J]. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 2010, 1800(8): 834-845.

[13]MANN S, MELDRUM F C. Controlled synthesis of inorganic materials using supramolecular assemblies[J]. Advanced Materials, 1991, 3(6): 316-318.

[14]MELDRUM F C, DOUGLAS T, LEVI S, et al. Reconstitution of manganese oxide cores in horse spleen and recombinant ferritins[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 1995, 58(1): 59-68.

[15]DOUGLAS T, STARK V T. Nanophase cobalt oxyhydroxide mineral synthesized within the protein cage of ferritin[J]. Inorganic Chemistry, 2000, 39(8): 1828-1830.

[16]OKUDA M, IWAHORI K, YAMASHITA I, et al. Fabrication of nickel and chromium nanoparticles using the protein cage of apoferritin[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 84(2): 187-194.

[17]KLEM M T, MOSOLF J, YOUNG M, et al. Photochemical mineralization of europium, titanium, and iron oxyhydroxide nanoparticles in the ferritin protein cage[J]. Inorganic Chemistry, 2008, 47(7): 2237-2239.

[18]WONG K K W, MANN S. Biomimetic synthesis of sulfide-ferritin nanocomposites[J]. Advanced Materials, 1996, 8(11): 928-932.

[19]YAMASHITA I, HAYASHI J, HARA M. Bio-template synthesis of uniform CdSe nanoparticles using cage-shaped protein, apoferritin[J]. Chemistry Letters, 2004, 33(9): 1158-1159.

[20]GALVEZ N, SANCHEZ P, DOMINGUEZ-VERA J M, et al. Apoferritin as a nanoreactor for preparing metallic nanoparticles[J]. Comptes Rendus Chimie, 2008, 11(10): 1207-1212.

[21]YANG X, AROSIO P, CHASTEEN N D. Molecular diffusion into ferritin: pathways, temperature dependence, incubation time, and concentration effects[J]. Biophysical Journal, 2000, 78(4): 2049-2059.

[22]YANG Zhen, WANG Xiaoyong, DIAO Huajia, et al. Encapsulation of platinum anticancer drugs by apoferritin[J]. Chemical Communications, 2007, 33: 3453-3455.

[23]YAMASHITA I, IWAHORI K, KUMAGAI S. Ferritin in the field of nanodevices[J]. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 2010, 1800(8): 846-857.

[24]KIM J W, CHOI S H, LILLEHEI P T, et al. Cobalt oxide hollow nanoparticles derived by bio-templating[J]. Chemical Communications, 2005, 32: 4101-4103.

[25]GALVEZ N, SANCHEZ P, DOMINGUEZ-VERA J M, et al. Apoferritin-encapsulated Ni and Co superparamagnetic nanoparticles[J]. Journal of Materials Chemistry, 2006, 16(26): 2757-2761.

[26]TOSHA T, NG H L, BHATTASALI O, et al. Moving metal ions through ferritin-protein nanocages from three-fold pores to catalytic sites[J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132(41): 14562-14569.

[27]LI Chaorui, FU Xiaoping, QI Xin, et al. Protein association and dissociation regulated by ferric ion: a novel pathway for oxidative deposition of iron in pea seed ferritin[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284 (25): 16743-16751.

[29]PRICE D, JOSHI J G. Ferritin: a zinc detoxicant and a zinc ion donor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1982, 79(10): 3116-3119.

[30]XING Ruimin, WANG Xiaoyong, ZHANG Changli, et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2009, 103(7): 1039-1044.

[31]ZHANG Lianbing, LAUG L, MU..NCHGESANG W, et al. Reducing stress on cells with apoferritin-encapsulated platinum nanoparticles[J]. Nano Letters, 2010, 10(1): 219-223.

[32]UCHIDA M, FLENNIKEN M L, ALLEN M, et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles[J]. Journal of the American Chemical Society, 2006, 128(51): 16626-16633.

Ferritin: A New Mineral Carrier for Supplement

WANG Zhen，LENG Xiao-jing* (College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The cavity of apoferritin can be used to transport various minerals. Since this protein can be absorbed by intestinal epithelial cells via entocytosis pathways, it becomes a new promising type of mineral nanocarrier. The process of deferrization for ferritin and mineral loading has been studied by transmission electron microscope (TEM), energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS), X-ray powder diffraction (X-Ray), mass spectroscopy (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS) and ultraviolet spectroscopy (UV), respectively. Recents applications of apoferritin carriers in the field of nutrition are summarized in this paper.

ferritin；apoferritin；mineral；carrier

R151.3

A

1002-6630(2012)01-0290-04

2011-01-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B04)

王震(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為鐵蛋白功能特性。E-mail：wangzhen022078@163.com

*通信作者：冷小京(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為可食用膜及微膠囊科學。E-mail：xiaojing.leng@gmail.com