響應面分析優化菊粉的羧甲基改性工藝

李丹丹，王雪嬌，周 杰，潘 燁，王 爽，高學佳

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

響應面分析優化菊粉的羧甲基改性工藝

李丹丹1，王雪嬌1，周 杰2，潘 燁1，王 爽1，高學佳1

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

研究菊粉的羧甲基改性工藝條件，以堿化時間、醚化溫度、醚化時間、堿用量以及氯乙酸用量為影響因素，以羧甲基的取代度為考察指標，運用Plackett-Burman設計篩選出3個對菊粉羧甲基取代度影響顯著因素，即堿化時間、醚化溫度和氯乙酸用量，采用響應面分析試驗優化菊粉的羧甲基改性工藝。菊粉的羧甲基改性最優工藝條件為菊粉用量6.8g、堿化時間30min、醚化溫度81℃、氯乙酸用量2.96g，此時菊粉的羧甲基取代度為0.66± 0.000167。

菊粉；羧甲基改性；Plackett-Burman試驗；響應面分析

菊粉又稱為菊糖，在菊科植物如菊芋、大麗菊等的塊莖和菊苣、牛蒡等的根中含量豐富，在植物中代替淀粉成為貯存多糖，是一種功能性的天然寡糖[1-2]。菊粉主要是由β-(2→1)果糖基-果糖為糖苷鍵連接而成的一種果聚糖，其果糖基單位(即聚合度，degree of polymerization，DP)從2個到60個不等[3]。菊粉具有降血脂[4]、促進金屬離子的吸收[5-6]、增殖雙歧桿菌、調節腸道環境[7-9]等功能。同時菊粉已經被FDA批準進入美國市場，并且在日本、歐洲、美國、臺灣等地被認為是食品和營養的增補劑而非食品添加劑，廣泛應用于食品工業中[10]。幾乎所有的資料都表明，菊粉和低果聚糖不存在安全性方面的擔憂，研究證明攝人量為40～70g/d時無不良的影響[11]。

目前，國內對菊粉的研究還局限在應用研究上，對菊粉的改性研究較少。國外對菊粉改性的研究越來越重視。目前國外研究較多的改性方式為甲氨酰化、酯化、烷氧基化等。改性菊粉多用于工業表面活性劑制備，改善水分表面張力或做為食品工業水處理的阻垢劑等。胡娟等[12]用菊粉與十八烷基異氰酸酯在有機溶劑中發生甲氨酰化反應，研究發現生成的氨甲基菊粉具有表面活性。羧甲基菊粉由菊粉分子上的伯醇或仲醇基團與氯乙酸等含有羧基基團(—COOH)的化合物在堿性條件下進行取代反應而形成。Verraest等[13]對菊粉的羧甲基改性進行了研究，并用液相色譜和核磁共振對改性的菊粉進行了分析。Johannsen[14]對羧甲基菊粉的毒理學性質進行了研究，結果表明具有良好阻垢效果的羧甲基菊粉的安全性和菊粉是一樣的，可以在日常膳食中放心食用。目前世界范圍內，國外科研機構對菊粉改性的研究相對成熟，但也只有荷蘭的Sensus和比利時的Solutia兩家公司在對菊粉衍生物進行聯合開發，投入大規模商業生產的菊粉衍生物目前僅有羧甲基菊粉，所使用的菊粉是從萵苣的種子中提取的。由于羧甲基菊粉是綠色環保產品，而且功能獨特，因而暢銷于歐美市場。

本研究以菊粉為原料制備羧甲基菊粉，其中堿化時間、醚化溫度、醚化時間、堿用量以及氯乙酸用量均對羧甲基的取代度有不同程度的影響，通過Plackett-Burman試驗和響應面分析確定菊粉羧甲基改性的最佳工藝條件，以期為今后菊粉的改性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊粉 荷蘭Sensus公司。

氫氧化鈉、氯乙酸、無水乙醇(均為AR) 河北省石家莊市金陵科教試驗設備公司。

1.2 儀器與設備

PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞而電器有限公司；756P型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；電子攪拌器 上海電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菊粉羧甲基改性工藝流程

菊粉在室溫(25℃)溶解度為13.6%，因此取6.8g菊粉溶解于50mL水中進行實驗。

1.3.2 菊粉羧甲基取代度的測定[15]

采用光度滴定法對菊粉的羧甲基化進行測定，因羧甲基菊粉與二價銅離子的螯合物在241nm波長處有較強的光吸收。用銅離子濃度為0.8×10-3mol/L的硫酸銅溶液滴定0.5g/L的羧甲基菊粉鈉溶液。令羧甲基菊粉鈉與二價銅離子生成螯合物，使用紫外-可見分光光度計在241nm波長處進行滴定。隨滴定進行樣品溶液的吸光度不斷增大，滴至螯合完畢，吸光度趨于恒定。此時通過消耗的硫酸銅溶液的體積可求得羧甲基的含量，進而計算出菊粉羧甲基化的取代度。取代度計算公式：

式中：W為取代基質量分數/%；M為取代基相對分子質量。

1.3.3 Plackett-Burman試驗

采用Plackett-Burman設計法和Minitab15數據處理軟件創建試驗次數N＝12的試驗，對堿化時間(A)、醚化時間(B)、醚化溫度(D)、氫氧化鈉用量(E)、氯乙酸用量(G)5個因素進行考察，另設3個虛擬列(C、F、H)，以考察試驗誤差，以羧甲基取代度為響應值考察各因素對菊粉羧甲基取代度影響的顯著性。

1.3.4 響應面分析

響應曲面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。本試驗利用Design-Expert 6.0.10數據處理軟件設計一個3因素3水平共15個試驗點的試驗，得到最佳的菊粉羧甲基改性工藝條件。

2 結果與分析

2.1 Plaekett-Burman試驗篩選結果

選用試驗次數N＝12的試驗設計，對8個因素(5個實際因素、3個虛擬因素)進行考察，分別對應于表1的8列，每個因素取2個水平，以羧甲基取代度為響應值。選擇置信度較高的因素作為顯著因素進一步考察，試驗設計及結果如表1所示，各因素主效應分析結果如表2所示。

表1 Plackett-Burman試驗設計表及試驗數據Table 1 Plackett-Burman design and experimental results

表2 Plaekett-Burman試驗設計的因素、水平及顯著性分析Table 2 Factors and levels used in Plackett-Burman design and significance analysis

取代度和羧甲基改性的多糖性能有直接關系。低取代度產品在某些性能上存在一定的局限性，主要表現在：水溶液抗生物降解性及抗溫性差，在冷水中溶解性較差，抗酸性及抗鈣鎂離子能力低等，這些缺陷會隨著取代度的增加而減弱。而取代度高的產品具有黏度高且穩定，抗酸、抗鹽、耐剪切等性能而更能滿足許多產品性質的需求[16-17]。由表1、2可以看出，因素堿化時間、醚化溫度、氯乙酸用量3個因素對羧甲基取代度的影響效果顯著，所以將堿化時間、醚化溫度和氯乙酸用量這3個因素進行進一步優化。

2.2 響應面分析法優化菊粉羧甲基化改性的條件

2.2.1 響應曲面試驗設計及結果

以Plackett-Burman試驗篩選出得3個顯著因素，結合單因素試驗，進行響應面分析試驗。響應面因素及水平見表3，響應面設計及試驗結果見表4。2.2.2 擬合模型的建立及顯著性分析

表3 菊粉羧甲基化改性響應面試驗設計的因素與水平Table 3 Factors and levels used in response surface analysis

表4 菊粉羧甲基化改性響應面試驗設計及結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 6.0.10軟件對表4中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到菊粉羧甲基取代度對堿化時間、醚化溫度和氯乙酸用量的二次多項回歸模型方程為：

取代度＝－0.88130＋0.053563A＋0.011877B＋0.19479C－8.51337×10-4A2－8.50370×10-5B2－0.038148C2＋2.85955×10-6AB－7.02621×10-4AC＋6.41421×10-4BC(2)

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表5可知，回歸模型的的F值為56.03，P＝0.0002＜0.01，表示該模型極顯著。失擬項的F值為2.56，P＝0.1848＞0.05，說明失擬項不顯著。由表5可知，B、A2、B2、C2項的影響是顯著的，而A、C、AB、BC、AC項對菊粉羧甲基化取代度的影響是不顯著的。3個試驗條件對取代度影響的主次順序為B＞C＞A。

2.2.3 響應曲面交互作用分析及優化結果

根據回歸分析結果做出A、B、C及各因素之間的交互作用對羧甲基取代度的影響如圖1所示。

圖1 各因素及交互作用對菊粉羧甲基取代度的影響Fig.1 Response surface of factors and interactions on the degree of substitution of carboxymethyl inulin

從圖1可以看出，每個因素都有雙向增長，即因素值增大則響應值增大；當因素取值增大到一定值時，響應值達到極值，之后隨著因素的增大，響應值逐漸減小。這是因為堿化時間過短，則構建活性中心不完全影響最終試驗結果；堿化時間過長，則構建的活性中心被破壞，也會使最終的取代度變小。醚化溫度低時，分子活性不足影響取代基取代過程；醚化溫度高時，添加的取代基會斷裂，分子分解，也會使最終的取代度變小。氯乙酸用量少時，取代基添加量少，氯乙酸利用率低；氯乙酸用量過多時，會破壞構建的活性中心，也會使最終的取代度變小。

通過對響應曲面的交互作用分析后，發現各因素之間的交互作用對取代度有重要的影響。因此需要對提取條件進行優化。根據回歸模型，通過軟件分析得到菊粉羧甲基改性的最優工藝條件為堿化時間30.37min、醚化溫度81.47℃和氯乙酸用量2.96g，在此條件下，菊粉的羧甲基取代度的理論值為0.70，為檢驗響應曲面法所得結果的準確性和可靠性，又考慮實際操作的便利，將最優提取工藝條件修正為堿化時間30min、醚化溫度81℃和氯乙酸用量2.96g，在修正后的優化提取工藝條件下，羧甲基菊粉的取代度為0.66±0.000167，因此采用響應曲面法所得的優化提取工藝參數準確、可靠。

3 結 論

本實驗通過Plackett-Burman試驗和響應面分析，確定菊粉羧甲基改性的最優工藝條件為堿化時間30min、醚化溫度81℃和氯乙酸用量2.96g。在此條件下羧甲基菊粉的取代度為0.66±0.000167。3個試驗因素對取代度影響的主次順序為B＞C＞A。本研究還有一些需要進一步研究解決的問題，如對羧甲基菊粉的毒理學研究、羧甲基菊粉做為阻垢劑的應用效果等有待于今后進一步深入研究。

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Optimization of Inulin Carboxymethylation by Response Surface Analysis

LI Dan dan1，WANG Xue-jiao1，ZHOU Jie2，PAN Ye1，WANG Shuang1，GAO Xue-jia1
(1. College of Biological Science of Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to find optimal conditions for the the carboxymethylation of inulin, we investigated the effects of amount of NaOH used for alkalization reaction, alkalization time, amount of chloroacetic acid used for etherification, and etherification temperature and time on substitution degree of carboxymethyl inulin. Using Plackett-Burman design, we identified alkalization time, etherification temperature and chloroacetic acid amount as important conditions that influence substitution degree of carboxymethyl inulin. Response surface methodology was employed to optimize the important conditions. Optimal carboxymethylation of inulin was achieved by alkalization for 30 min and etherification with 2.96 g of chloroacetic acid per 6.8 g of inulin at 81 ℃. The substitution degree of the obtained carboxymethyl inulin was 0.66 ± 0.000167.

inulin；carboxymethylation；Plackett-Burman design；response surface methodology

TS213.2

A

1002-6630(2012)18-0063-04

2011-07-05

李丹丹(1981—)，女，講師，博士，研究方向為碳水化合物與生物技術。E-mail：dandan_jiejie@yahoo.com.cn