二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的制備及理化性質研究

李 琳，李穩宏,*，雒 羽，趙 鵬，雷雨辰，滕家輝，馬 偉

(1.西北大學化工學院，陜西 西安 710069；2陜西中醫學院藥學院，陜西 咸陽 712046；3.中國科學院大連化學物理研究所，分子反應動力學國家重點實驗室，遼寧 大連 116023)

二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的制備及理化性質研究

李 琳1，李穩宏1,*，雒 羽1，趙 鵬2,3，雷雨辰1，滕家輝1，馬 偉1

(1.西北大學化工學院，陜西 西安 710069；2陜西中醫學院藥學院，陜西 咸陽 712046；3.中國科學院大連化學物理研究所，分子反應動力學國家重點實驗室，遼寧 大連 116023)

目的：研究二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物(LPC)的最佳合成工藝及其理化性質。方法：采用響應面分析法對LPC合成條件進行優化，并根據LPC的水解及還原性實驗判斷其在生理條件下的穩定性。結果：LPC的最佳合成工藝為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉的質量配比5:1、反應液pH8，且理化性質穩定。結論：LPC具有較好的理化性質，有望開發成為一種新型的補鐵劑。

二色補血草；多糖鐵配合物；響應面分析方法；理化性質

二色補血草(Limonium bicolor)為藍雪科(Plumba ginaceae)補血草屬的多年生草本植物，別名蒼蠅花、蠅子草，主要分布于我國陜西、河北、山西、甘肅等地。二色補血草可全草入藥，性味甘、微澀苦、無毒。主要功效為補血、止血、散瘀、調經、益脾、健胃等[1-2]，主治崩漏、尿血、月經不調等癥[3-4]。近年來研究發現，多糖鐵(Ⅲ)配合物作為補鐵劑不僅具有合適的配合穩定性，對胃腸道無或甚少刺激作用，而且當其釋放鐵之后，配體多糖具有多方面的生物活性，是對肌體有益的成分，不會產生毒副作用[5-8]。

鑒于二色補血草本身所具有的補血功能，本研究利用其為原料，從中提取二色補血草多糖，與鐵(Ⅲ)進行絡合反應，探討制備二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的工藝路線，并對該配合物理化性質進行初步研究，為將二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物開發成為一種營養型口服補鐵劑打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

二色補血草 西安萬壽路中藥材批發市場；檸檬酸三鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、K4[Fe(CN)6]、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇等均為分析純；LS-206型大孔樹脂 西安藍曉科技新材料股份有限公司；實驗用水為雙蒸水。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-2401紫外-可見分光光度計、S7-AA-7000型原子吸收光譜儀 日本島津公司；DZF-602真空干燥箱上海申賢恒溫設備廠；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海嘉鵬科技有限公司；TGL-16C型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-2C酸度計 上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 二色補血草多糖的制備

用95%乙醇對二色補血草進行脫脂，將脫脂后的藥材置于圓底燒瓶中按一定的料液比加入蒸餾水，在熱水中浸提，趁熱抽濾，濃縮，加入一定量的無水乙醇醇沉，靜置得二色補血草粗多糖沉淀。后將粗多糖溶于水，用Sevag法除蛋白后，經過LS-206型大孔樹脂進行脫色，濃縮，醇沉，靜置，過濾，沉淀依次用乙醇、丙酮抽洗，真空干燥，得二色補血草多糖白色無定形粉末。經過苯酚-硫酸法[9]測得多糖含量為48.9%。

1.2.2 LPC的合成工藝

稱取二色補血草純化多糖適量，檸檬酸三鈉0.5g，置于史萊克管中，溶于少量水中，置水浴中加熱并不斷攪拌。在不斷攪拌的過程中，同時緩緩交替滴加2mol/L三氯化鐵溶液和20%氫氧化鈉溶液，控制溶液的pH8.0～8.5。當反應液中出現棕紅色不溶性沉淀時，立即停止滴加FeCl3和NaOH溶液，繼續在熱水浴中攪拌1h。反應液冷卻后，3500r/min離心15min。棄去沉淀，收集離心液。離心液中加入3倍量的無水乙醇，攪拌均勻，靜置后過濾，濾餅分別用甲醇、9 5%乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥，得棕褐色二色補血草鐵(Ⅲ)粗品，后再對其進行透析純化，去除粗品中的小分子雜質，得二色補血草鐵(Ⅲ)。工藝流程見圖1。鐵含量的測定采用鄰菲羅啉分光光度法測定[10]。

圖1 二色補血草多糖鐵合成工藝流程圖Fig.1 Flow chart of LPC preparation process

1.2.3 二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優化

依據Box-Behnken試驗設計原理，在前期單因素試驗的基礎之上，選取水浴溫度、多糖與檸檬酸三鈉配比、pH值3個因素進行響應面優化試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 產品LPC中鐵含量測定[13]

采用GB 11911—1989《水質 鐵、錳的測定：火焰原子吸收分光光度法》測定LPC中鐵的含量。原子吸收光譜條件：在50B原子吸收光譜儀上，用火焰法，在燈電流5.0mA、狹縫0.5nm、波長248.3nm、火焰高度7.5mm、空氣流6.5L/min、乙炔流量1.5L/min。

1.2.5 產品LPC理化性質測定

1.2.5.1 產品LPC一般物理性質測定

考察產品LPC的溶解性、熔點、溶液pH值等一般物理性質，透析除鹽后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]檢驗其水溶液，檢測Fe(Ⅲ)離子的特殊顯色效應。

1.2.5.2 產品LPC的水解實驗

補鐵劑在鐵吸收的主要部位——十二指腸是否可溶，是補鐵劑生物利用度高低的關鍵之一。對LPC、三氯化鐵、硫酸亞鐵3種含鐵劑進行水解實驗，觀察它們在不同pH值時的穩定情況。

配制含鐵濃度均為0.01mol/L的LPC、三氯化鐵、硫酸亞鐵溶液，各精密量取20mL，用0.01mol/L的氫氧化鈉標準溶液分別滴定；同時用測定反應溶液pH值變化情況。

1.2.5.3 產品LPC的還原性實驗

采用鄰菲羅啉比色法對LPC進行還原性實驗，其基本原理為：在酸性條件下以抗壞血酸為還原劑，將多糖鐵中的三價鐵離子還原為二價，二價鐵離子與鄰菲羅啉生成一種紅色螯合物，根據其顏色的深淺得出溶液中鐵含量的高低。

量取1mmol/L的LPC溶液5.0mL，分別置于8個50mL容量瓶中，控制p H值分別為1、2、3、4、5、6、7、8，再分別加入10%抗壞血酸溶液1.0mL，0.12%鄰菲羅啉試劑5.0mL，定容至刻度，恒溫37℃水浴條件下還原，取不同時間點的反應溶液于510nm波長處測定吸光度，考察產品LPC的還原性，以不加LPC溶液作為空白。

2 結果與分析

2.1 二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝條件優化

2.1.1 響應面試驗結果及擬合模型

響應面面試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 二色補血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優化響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for Fe content of LPC with various extraction conditions

從表3可以看出，模型的顯著性F＝40.10＞0.05，r＝223.36/227.69＝0.9810，顯著性水平P＜0.001，表明模型顯著，此外模型方程失擬項很小，可認為方程對試驗結果擬合情況較好，試驗誤差小，因此能夠對實驗的結果進行分析預測[11-12]。從方差分析表可以看出，反應液pH值對提取影響最為顯著，其次是檸檬酸三鈉的質量配比和水浴溫度。方程的一次、二次項顯著性水平P＜0.05，影響顯著，說明各個試驗的因子對響應值的影響并非為線性關系。經對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：

2.1.2 等高線圖和響應面圖分析

利用Design Expert軟件對二次回歸方程優化響應面及等高線圖見圖2。

圖2 各兩因素交互作用對LPC鐵含量影響的響應面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of synthesis conditions on Fe content of LPC

由圖2可知，反應液pH值的影響最為顯著，曲面較陡；檸檬酸三鈉的質量配比和水浴溫度次之，二者的曲面相對平滑一些。由回歸方程得到的優化合成工藝條件為：水浴溫度72.8℃、多糖與檸檬酸三鈉的質量配比4.68:1、反應液pH8.15。回歸模型預測在此二色補血草多糖鐵合成最佳工藝條件下，多糖鐵中鐵含量為20.7774%。

按照最優工藝條件進行驗證實驗，考慮到實驗的可操作性，將最優工藝條件修正為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉質量配比5:1、反應液pH8，通過3次平行驗證實驗得到二色補血草多糖鐵中平均鐵含量為20.48%，與理論預測值吻合良好，說明應用響應面優化法得到的優化工藝參數是準確可靠的。

2.2 產品LPC的鐵含量

產品LPC中鐵含量測定結果為20.27%，此結果表明：用鄰菲羅啉分光光度法測定LPC中鐵含量的方法簡捷快速，精密度高，鐵含量測定結果與原子吸收光譜法測定結果一致。

2.3 LPC的理化性質

2.3.1 LPC的一般物理性質

LPC是無定形棕褐色粉末，無臭、無味，易溶于水，其水溶液呈中性，有丁達爾現象，不溶于無水乙醇、無水甲醇、乙醚等有機溶劑。熔點高于3 0 0℃。透析除鹽后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]檢驗其水溶液，結果不顯示Fe(Ⅲ)離子的特殊顯色效應。證實LPC水溶液中不存在游離的Fe3+，說明生成了較為穩定的配合物。

2.3.2 LPC的水解實驗[14]

圖3 三種含鐵劑的NaOH滴定曲線Fig.3 NaOH titration curves of three kinds of iron supplements

由圖5可知，FeCl3開始渾濁時的pH2.64，出現大量渾濁時的pH6.71。FeSO4開始渾濁時的pH3.32，出現大量渾濁時的pH6.78。LPC在pH12時仍無渾濁。但是，當pH值逐漸減小至3.5時，LPC開始出現沉淀，并且pH值越小沉淀量越大。說明LPC在pH3.5～10.5范圍內具有特別的穩定性，在強酸條件下LPC的結構被破壞，生成了不溶物。

2.3.3 LPC的還原性實驗[15]

圖4 二色補血草多糖鐵與抗壞血酸反應體系的A-t曲線Fig.4 A-t curves of the reaction system between LPC and vitamin C

由圖4可知，LPC中的鐵可以被還原劑還原，30min內幾乎可以全部溶出，溶出率達到100%。可見LPC有良好的溶出被還原性能，可以說明LPC作為口服補鐵劑可被食物中的某些還原性物質將其中的三價鐵還原成二價鐵，進而被機體吸收利用，有較好的生物利用度，由于沒有游離的Fe3+存在，所以LPC對消化道無明顯的刺激作用。

3 討 論

3.1 本實驗以二色補血草為原料，在單因素試驗的基礎上采用響應面法對其合成多糖鐵工藝條件進行優化，得到合成LPC最佳工藝為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉的質量配比5:1、反應液pH8。

3.2 產品LPC的鐵含量實驗結果表明：鄰菲羅啉分光光度法測定LPC中鐵含量的方法簡捷快速，精密度高，鐵含量測定結果與原子吸收光譜法測定結果吻合良好。

3.3 LPC溶于水呈深紅棕色透明溶液，有丁達爾現象，說明LPC和氫氧化鐵溶液一樣，也是一種膠體溶液。據觀察，這種膠體溶液相當穩定，長期放置不發生聚沉，顏色均一且透明。

3.4 口服補鐵劑的主要吸收部位是在十二指腸(pH6～7)，要求補鐵劑具有可溶性，并以此作為判斷補鐵劑生物利用度高低的主要指標。由圖3、4可以看出LPC在生理pH條件下可溶且能夠穩定存在，但作為口服補鐵劑不宜空腹服用(空腹時，胃液pH＜3)，并且三價鐵在pH1～8范圍內能夠較迅速的還原成二價鐵，說明LPC若作為補鐵劑可被食物中的還原性物質(抗壞血酸)將三價鐵還原成二價鐵后被機體吸收，有較好的生物利用度，又因溶液中無游離的Fe3+存在，所以應無明顯的消化道刺激作用。

[1] 吳冬青, 安紅鋼, 林敏, 等. 二色補血草不同部位總黃酮含量的測定[J]. 光譜實驗室, 2006, 23(1): 127-129.

[2] 張連茹, 鄒國林, 楊天鳴. 麻黃水溶性多糖的提取及其清除氧自由基作用的研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2000, 22(3): 65-67.

[3] SAS G, NEMESASZKY E, BRAUER H. On the therapcutic effects of trivalent and divalent iron deficiency anemia[J]. Arznelm-Forsch/Drug Res, 1984, 34(1): 1575-1579.

[4] ZHUSUPOVA G E, ARTAMONOVA N A, ABILOV Z A, et al. Lipophilic pigments and fatty acids from theaerial parts of certain plant species of the genusLimonium.Ⅶ[J]. Chemistry of Natural Compounds,2006, 42(5): 512-514.

[5] ANIYA Y, MIYAGI C, NAKANDAKARI A, et al. Free radical scavenging action of the medicinalherbLimonium wrightiifrom the Okinawa islands[J]. Phytomedicine, 2002, 9(3): 239-244.

[6] TANG X H, GAO J, CHEN J, et al. Mitochondrial modulation is involved in the hepatoprotection ofLmionium sinenseextractagainst liverdamage inmice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 120(3): 427-431.

[7] 王耀莉, 史鎖洪, 朱霖, 等. 多糖鐵復合物治療兒童缺鐵性貧血[J].新藥與臨床, 1994, 13(4): 251-252.

[8] 楊真, 歲海古. 缺鐵性貧血及補鐵劑研究進展[J]. 國外醫學衛生學分冊, 2006, 33(2): 90-93.

[9] 張惟杰. 糖復合物生化研究技術[M]. 2版. 杭州: 浙江大學出版社,1997: 11.

[10] 李玉賢, 游志恒, 褚意新. 百合多糖鐵復合物的合成及其鐵含量的測定[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(7): 47-49.

[11] 崔易, 李穩宏, 唐璇, 等. 胭脂蟲紅色素提取工藝優化研究[J]. 化學工程, 2007, 35(6): 66-69.

[12] 劉軍海, 任惠蘭, 官波, 等. 響應面分析法優化白術多糖提取工藝[J].中成藥, 2008, 30(5): 667-690.

[13] 國家環境保護局. GB 11911—1989 水質鐵、錳的測定: 火焰原子吸收分光光度法[S]. 北京: 中國標準出版社, 1989.

[14] 王凱平, 張玉, 戴立泉. 當歸多糖鐵理化性質的初步研究[J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(9): 747-750.

[15] 李玉賢, 裴曉紅. 大棗多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及一般性質研究[J].中成藥, 2006, 28(5): 707-709.

Synthesis and Physicochemical Properties ofLimonium bicolorPolysaccharide-Fe (Ⅲ) Complex

LI Lin1，LI Wen-hong1,*，LUO Yu1，ZHAO Peng2,3，LEI Yu-chen1，TENG Jia-hui1，MA Wei1
(1. College of Chemistry Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, China；2. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China；3. State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)

Objective: To explore the best synthetic process ofLimonium bicolorpolysaccharide-Fe (III) complex (LPC) and its physical and chemical properties. Methods: The synthetic process conditions were optimized by response surface methodology.The stability of LPC under physiological conditions was evaluated by its hydrolysis characteristics and reducibleness. Results: The optimal synthetic conditions were water bath temperature of 73℃, polysaccharides-to-C6H5Na3O7·2H2O ratio of 5:1 and reaction pH of 8. The prepared LPC was stable under physiological pH environment. Conclusion: LPC has excellent physicochemical properties and can be used as a new iron supplement.

Limonium bicolor；polysaccharide-Fe (Ⅲ)；response surface methodology；physicochemical properties

R284.1

A

1002-6630(2012)16-0054-05

2011-06-16

陜西省教育廳專項(2010JK521)

李琳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為天然藥用活性成分分離純化。E-mail：lilinsidan@sina.com

*通信作者：李穩宏(1950—)，男，教授，研究方向為天然生物提取、分離與純化。E-mail：liwenhong@nwu.edu.cn