紫甘薯花色苷酶法提取及純化

鮑 誠，李 玲，湯海賓，申京宇,*

(1.煙臺大學生命科學院，山東 煙臺 264005；2.威海億晶原果蔬有限公司，山東 威海 264400)

紫甘薯花色苷酶法提取及純化

鮑 誠1，李 玲1，湯海賓2，申京宇1,*

(1.煙臺大學生命科學院，山東 煙臺 264005；2.威海億晶原果蔬有限公司，山東 威海 264400)

研究酶法提取紫甘薯花色苷的工藝條件。通過單因素和正交試驗，探討酶解溫度、pH值、料液比、酶用量對花色苷提取率的影向，確定最佳提取工藝。結果表明，最佳提取工藝為溫度50℃、pH5.5、料液比1:15、α-淀粉酶用量0.25%、果膠酶用量0.10%。利用AB-8型大孔樹脂，在吸附液pH2、流速為1mL/min時，吸附質(zhì)量濃度為26.57mg/100mL；用pH3、60%乙醇溶液為解吸液，流速為2mL/min的條件下解吸，紫甘薯花色苷得率2.71mg/g，色價為43.2。

紫甘薯花色苷；酶法提取；α-淀粉酶；果膠酶；大孔樹脂；純化

紫甘薯(Ipomoes batatasL.)屬旋花科一年或多年生草本植物，其肉色呈紫或深紫色，故稱為紫甘薯，又稱為紫心甘薯、紫薯、山川紫等[1]。它除具有普通甘薯的營養(yǎng)成分外，還富含花色苷等生物活性成分[2]。由于紫甘薯的花色苷含量很高，常作為提取天然花色苷的主要原料。紫甘薯花色苷的提取常用水提法、酸化水提法和酸化乙醇提法[3-4]。酶法提取紫甘薯花色苷的研究甚少，一般采用纖維素酶[5]或果膠酶[6]等單一酶提取方法，本實驗選取α-淀粉酶和果膠酶進行雙酶法提取工藝研究，旨在更有效地破壞細胞壁和細胞膜，使存在于液泡內(nèi)的花色苷能擴散至溶劑中，提高花色苷的得率[6]。酶法提取的花色苷粗提液中含有糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，極大地影響了花色苷的品質(zhì)和穩(wěn)定性[7]，需對其進行純化。本實驗選用大孔樹脂對紫甘薯花色苷進行純化最終得到較高色價的紫甘薯花色苷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯 威海億晶原果蔬有限公司；α-淀粉酶(2000U/g) 北京奧博星生物技術有限責任公司；酸性果膠酶(4000U/mL) 帝斯曼食品有限公司；AB-8大孔樹脂上海藍季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52A型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；JENCO 6173型酸度計 上海任氏電子有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；7312-Ⅰ型電動攪拌機 上海標本模型廠；DD-5M低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘薯花色苷提取工藝

紫甘薯解凍后，削皮、擦絲，于護色液(0.15%異VC鈉，0.45%檸檬酸溶液)中護色40min，在護色液中糊化(80℃、5min)后打漿，調(diào)至酶解所需pH值，加入α-淀粉酶，電動攪拌輔助酶解1h后，加入果膠酶繼續(xù)酶解2h，酶解液4000r/min離心30min后，抽濾取上清液，于90℃滅酶10min，冷卻后調(diào)至pH3，得花色苷初提液。

對α-淀粉酶和果膠酶的用量、酶解溫度、p H值、料液比等因素進行單因素試驗，根據(jù)單因素試驗結果進行4因素3水平的正交試驗，以確定最佳提取工藝。

1.3.2 紫甘薯花色苷的純化

參照岳靜[8]和王智勇[9]的方法，對純化條件進行優(yōu)化，得到最佳吸附液質(zhì)量濃度及pH值、最佳解析液濃度及pH值。將適量AB-8大孔樹脂裝入3cm×30cm層析柱，將粗提液濃縮至最佳吸附質(zhì)量濃度26.57mg/100mL、酸度調(diào)節(jié)至最佳吸附酸度條件pH2.0，以1mL/min速度上樣，解析前用pH3的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗去極性較大的雜質(zhì)成分[10-11]，用pH3、60%乙醇溶液，以2mL/min流速進行解吸，解吸液經(jīng)濃縮后得到紫甘薯花色苷濃縮液。

1.3.3 色價測定方法

參照楊朝霞[12]的色價測定方法，計算色價。

式中：A為吸光度；m為樣品質(zhì)量/g；k為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 總糖及還原糖的測定方法

參照國標GB 6194—1986《水果、蔬菜可溶性糖測定法》方法測定總糖和還原糖的含量。

1.3.5 花色苷含量的測定

參照王智勇[9]的方法，采用莧菜紅作為對照品，在525nm波長處測定吸光度(A)，按下列公式計算紫甘薯花色苷的含量和得率。

式中：C為花色苷含量/(μg/mL)；V為樣液總體積/mL；m為紫甘薯取樣量/g。

2 結果與分析

2.1 最佳提取工藝單因素試驗

2.1.1α-淀粉酶用量對紫甘薯花色苷得率的影響

取50g紫甘薯在料液比1:5、酶解溫度45℃、α-淀粉酶0.1%～0.35%、果膠酶0.15%、酶解pH5的條件下，按1.3.1節(jié)所述工藝進行提取。由圖1可知，花色苷得率隨α-淀粉酶用量的增加而增加，α-淀粉酶用量達到0.3%時，得率達到最高。隨后得率急劇下降，可能是由于過量的α-淀粉酶雖然分解包裹色素的淀粉，使色素游離出來；但同時也分解了保護色素的糊精類物質(zhì)，降低了色素的穩(wěn)定性，使色素含量降低[13]。故選擇0.3%為最佳α-淀粉酶用量。

圖1 α-淀粉酶用量對紫甘薯花色苷得率的影響Fig. 1 Effect of α-amylase dosage on extraction rate of purple sweet potato anthocyanins

2.1.2 果膠酶用量對紫甘薯花色苷得率的影響

取50g紫甘薯在料液比1:5、酶解溫度45℃、α-淀粉酶0.3%、果膠酶0.05%～0.25%、酶解pH5的條件下，按1.3.1節(jié)所述工藝進行提取。由圖2可知，花色苷得率隨果膠酶用量的增加而提高，到果膠酶用量達到0.15%時，得率達到最大。隨后得率明顯下降，是由于過量的果膠酶雖然能破壞細胞壁，促進花色苷暴露并與提取溶劑接觸，但同時也讓部分原來被包裹的可溶性成分如果膠等物質(zhì)溶出，增加對花色苷的包裹，結果使得率降低[14]。因此，選擇0.15%為最佳果膠酶用量。

圖2 果膠酶用量對紫甘薯花色苷得率的影響Fig.2 Effect of pectinase dosage on extraction rate of purple sweet potato anthocyanins

2.1.3 料液比對紫甘薯花色苷得率的影響

取50g紫甘薯在料液比1:5～1:25，酶解溫度45℃、α-淀粉酶0.3%、果膠酶0.15%、酶解pH5條件下，按1.3.1節(jié)所述工藝進行提取。由圖3可知，花色苷得率隨提取液體積的增加而增大，料液比1:15時達到最高，隨后提取液體積增加到1:20和1:25時，得率急劇下降。故選擇1:15為最佳料液比。

圖3 料液比對紫甘薯花色苷得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction rate of purple sweet potato anthocyanins

2.1.4 酶解溫度對紫甘薯花色苷得率的影響

取50g紫甘薯在料液比為1:15，酶解溫度40～60℃、α-淀粉酶0.3%、果膠酶0.15%、酶解pH5條件下，按1.3.1節(jié)所述工藝進行提取。實驗中使用的α-淀粉酶最適溫度為50～70℃，果膠酶為40～55℃。由圖4可知，由于在較低溫度條件下兩種酶活力未完全激活，酶反應不充分而導致花色苷得率較低，當溫度升高到45℃時，酶反應速度加快而花色苷的得率有了明顯的提高。但是，溫度達到50℃時，得率反而降低，這主要是由于此時α-淀粉酶的反應能力較弱的原因之外，花色苷結構隨溫度的升高，向無色的查爾酮和甲醇假堿式結構轉化而引起的[15]。在55℃時，得率有所反彈，可能是由于α-淀粉酶和果膠酶的反應加速而引起的。溫度達到60℃時，得率顯著下降，是除了果膠酶的反應能力降低因素外，溫度對花色苷結構穩(wěn)定性的影響增加，大量花色苷轉化為不可逆的查爾酮無色結構而造成的[15]。故選擇45℃為最佳酶解溫度。

圖4 酶解溫度對紫甘薯花色苷得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate of purple sweet potato anthocyanins

2.1.5 酶解pH值對紫甘薯花色苷得率的影響

取50g紫甘薯在料液比1:15，酶解溫度45℃、α-淀粉酶0.3%、果膠酶0.15%、酶解pH3.5～6.0的條件下，按1.3.1節(jié)所述工藝進行提取。由圖5可知，由于實驗用的α-淀粉酶最適pH5.5～7.5，果膠酶最適pH4.0～5.5。為此，在pH4.0～5.5范圍內(nèi)，花色苷得率較pH3.5和pH6.0時明顯提高。但是，由于花色苷在pH4～6時，主要以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿形式存在，就直接應影響了花色苷的得率[15]。當pH5.5時，花色苷得率突然反彈，可能是α-淀粉酶的反應速度加快起了主要作用而引起的。pH值提高到6.0時，得率顯著下降是由于果膠酶活力喪失和花色苷本身結構的轉化等因素綜合引起的。故選擇pH4為最佳酶解pH值。

圖5 酶解pH對紫甘薯得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis pH on extraction rate of purple sweet potato anthocyanins

2.2 提取工藝條件正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，進行L9(34)正交試驗優(yōu)化提取工藝條件。

表1 酶法提取紫甘薯花色苷正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing enzymatic extraction of purple sweet potato anthocyanins

由表1可知，紫甘薯花色苷最佳提取條件為α-淀粉酶用量0.25%、果膠酶用量0.1%、酶解pH5.5、酶解溫度55℃。其中最大影響因素為酶解溫度，其次是果膠酶，再次是α-淀粉酶，pH值影響相對較小。

通過SPSS 10.0對正交試驗結果進行方差分析，結果見表2。

表2 正交試驗方差分析Table 2 Variance analysis of the experimental results of orthogonal array design

由表2可見，4因素對試驗均有顯著影響，影響順序與表1相同。結合Duncan多重比較發(fā)現(xiàn)，酶解溫度50℃和55℃條件下，花色苷提取率無顯著性差異?？紤]到過高溫度對花色苷有一定的破壞作用，最終確定酶解溫度50℃(D2)為最佳提取溫度，即最佳提取工藝為A2B2C3D2。該提取工藝得到的花色苷得率理論值為2.58mg/g，95%置信區(qū)間為(2.58±0.13)mg/g。取250g紫甘薯用最佳提取工藝進行3次平行實驗，花色苷得率平均值為2.49mg/g，經(jīng)驗證實驗最終確定提取工藝為A2B2C3D2。

2.3 花色苷粗提液的純化

在最佳工藝條件下提取的花色苷粗提液，花色苷得率為2.49mg/g，總糖含量為8.60g/100g，還原糖含量為5.71g/100g；Daravingas在研究中發(fā)現(xiàn)糖及其降解產(chǎn)物均能引起花色苷的降解[16]，通過最佳純化工藝純化后，糖含量顯著降低，總糖含量為0.18g/100g，還原糖含量為0.07g/100g，保證了花色苷的品質(zhì)。純化后花色苷得率為2.71mg/g，色價達到43.2。

3 結 論

通過雙酶法提取的紫甘薯花色苷含量比韓永斌等[6]利用果膠酶和α-淀粉酶單一酶法提取的紫甘薯花色苷含量明顯高。雙酶法可提高花色苷的提取率，且操作簡單，經(jīng)濟高效，對多種酶提取紫甘薯花色苷提供了一定的理論基礎。本實驗利用兩種酶提取紫甘薯花色苷，得到最佳工藝為溫度50℃、pH5.5、料液比1:15、α-淀粉酶用量0.25%、果膠酶用量0.10%。有關兩種酶之間相互作用和影響及其機理，有待于進一步深入研究。

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Enzymatic Extraction and Purification of Anthocyanins from Purple Sweet Potato

BAO Cheng1，LI Ling1，TANG Hai-bin2，SHEN Jing-yu1,*
(1. School of Life Sciences, Yaitai University, Yantai 264005, China；2. Weihai Yijingyuan Fruits and Vegtables Co. Ltd., Weihai 264400, China)

The enzymatic hydrolysis of purple sweet potato was investigated for anthocyanin extraction. The effects of extraction temperature, pH, solid-to-solvent ratio, and enzyme amount on extraction rate of anthocyanins were explored by onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods. The best extraction results were achieved by adding 0.25%α-amylase and 0.1% pectinase for hydrolysis at pH 5.5, 50 ℃, and a solid-to-solvent ratio of 1:15. The extract was adjusted to pH 2 and a concentration of 26.57 mg/100 mL for adsorption by AB-8 macro-porous resin at a flow rate of 1 mL/min and subsequent desoroption with 60% acidic ethanol solution at pH 3. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanins was 2.71 mg/g, and the color value of the purified anthocyanins was 43.2.

purple sweet potato anthocyanins；enzymatic extraction；α-amylase；pectinase；macro-porous resins；purification

TS246.4

A

1002-6630(2012)16-0059-04

2011-07-03

鮑誠(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：zihencc1319@163.com

*通信作者：申京宇(1965—)，男，副教授，博士，研究方向為功能食品加工、食品安全。E-mail：jyshen119@163.com