豬胃黏蛋白偶聯磁珠和聚乙二醇富集檢測青蔥和葡萄中諾如病毒的比較研究

張其剛，潘良文*，李 想，方 筠，TIAN Peng

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；3. Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Albany, CA 94710, USA)

豬胃黏蛋白偶聯磁珠和聚乙二醇富集檢測青蔥和葡萄中諾如病毒的比較研究

張其剛1,2，潘良文1,*，李 想1，方 筠1，TIAN Peng3

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；3. Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Albany, CA 94710, USA)

目的：以青蔥與葡萄為材料，建立以豬胃黏蛋白偶聯磁珠(PGM-MB)和聚乙二醇8000(PEG8000)富集檢測水果、蔬菜中諾如病毒的方法。方法：確定病毒原液中的相對病毒量，梯度稀釋病毒原液并進行實時熒光-聚合酶鏈式反應檢測，以每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數值與病毒量(實時熒光-聚合酶鏈式反應單位數)的常用對數值繪制標準曲線和線性方程；人工接種諾如病毒于青蔥與葡萄表面，洗脫后，分別用PEG8000和PGM-MB富集諾如病毒，實時熒光-聚合酶鏈式反應擴增，用標準曲線對回收的病毒進行相對定量。結果：基質為青蔥時，高接種量條件下，兩種富集方法的病毒回收效果相當，低接種量下，PGM-MB法的富集回收率高于PEG8000法，且PGM-MB的檢測下限更低；基質為葡萄時，PGM-MB法的富集回收率均高于PEG8000法，且檢測下限更低。結論：PGM-MB富集效果良好，快速方便，適合應用于水果和蔬菜中的諾如病毒的富集檢測。

諾如病毒；豬胃黏蛋白偶聯磁珠；聚乙二醇8000；實時熒光-聚合酶鏈式反應

諾如病毒屬于杯狀病毒科，是人類非細菌性急性腸胃炎的主要病原體[1]。諾如病毒的基因組為7.5kD左右的單股正鏈RNA，按照RNA聚合酶區和衣殼蛋白區的核苷酸與氨基酸序列，可分為5個基因組型。其中GI、GII、GIV型可感染人類，GIII、GV型只感染動物，GII型是引起食品感染的主要致病型[2-3]。

以食物和水為載體的“糞-口”途徑是諾如病毒傳播的主要途徑[4]，食用受污染的食物和水均會使人患急性腸胃炎。食品中諾如病毒檢測的報道多關于貝類，但最近研究表明，水果、蔬菜也是諾如病毒感染的重要載體[5-7]。水果、蔬菜中諾如病毒的富集方法主要有聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀、超濾濃縮與膜過濾[8]，這些方法分別有耗時長、設備要求高、步驟較多等缺點。近幾年的文獻報道表明，人類組織血型抗原(histo-blood group antigens，HBGA)是諾如病毒入侵人體的受體[9-10]。豬胃黏蛋白(porcine gastric mucin，PGM)含有多種組織血型抗原，豬胃黏蛋白偶聯磁珠(porcine gastric mucin-conjugated magnetic beads，PGMMB)可結合不同基因型的諾如病毒株。國外已有利用PGM-MB富集檢測水、生菜、草莓中諾如病毒的報道[11-12]。

國內鮮有檢測水果、蔬菜中諾如病毒的報道，相關的檢測方法也未建立。PEG8000沉淀法在富集食品中諾如病毒的運用最為廣泛，潘良文[13]、劉軍義[14]等以此建立了檢測貝類中諾如病毒的標準。本研究分別用PEG8000和PGM-MB富集方法，對青蔥與葡萄基質中諾如病毒的富集檢測進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GII.4諾如病毒 上海國際旅行衛生保健中心；PGMMB 美國農業部西太平洋農業研究中心；青蔥、葡萄上海市徐匯區水果菜市場。

1×PBS緩沖液 上海生工生物工程有限公司；甘氨酸緩沖液、CBS緩沖液(0.0745mol/L檸檬酸，0.0255mol/L檸檬酸鈉，pH3.6)、PEG8000溶液(16% PEG8000，0.525mol/L NaCl) 上海朗晟生物科技有限公司；TIANamp病毒RNA提取試劑盒(Cat. No. SD101) 北京天根生物科技有限公司；Prime ScriptTM反轉錄試劑盒(Cat.No. DRR036A)、Premix ExTaqTM實時熒光擴增試劑盒(Cat. No. DRR039S) 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

5810R型臺式離心機、ThermoStat plus恒溫孵育器、Mastercycler Gradient PCR儀 德國Eppendorf公司； Roto-Shake?Genie Rotator/Rock 多功能搖床 美國Scientific Industries公司；ABI Prism?7300型熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒原液的制備

用1×PBS緩沖液10倍稀釋病毒糞便樣品，充分混勻，8000×g離心20min后得到病毒懸浮液，分裝為每管20μL，作為病毒原液，－80℃保存備用。

1.3.2 RT-PCR單位的確定和標準曲線繪制

諾如病毒目前還不能進行體外培養，對其難以準確定量。梯度稀釋病毒原液，定義用實時熒光-聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)方法能穩定檢出的最高稀釋倍數10-x(x＞0)的病毒懸浮液中所含的病毒量為1個RT-PCR單位(RTU)。

以140μL 104、103、102、10RTU和1RTU的5個濃度梯度的病毒懸浮液，用TIANamp病毒提取試劑盒提取病毒RNA，反轉錄，實時熒光RT-PCR擴增繪制標準曲線。

1.3.3 病毒的人工接種

稱取5g新鮮的葡萄或青蔥樣品，在樣品表面均勻接種14μL諾如病毒懸浮液，于生物安全柜內放置30min至病毒懸浮液完全被樣品表面吸附并干燥。另取葡萄或青蔥樣品，不進行接種處理作為陰性對照。

1.3.4 病毒的富集與RNA提取

PEG8000富集法：將樣品放入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液。多功能搖床室溫振蕩30min，4℃、3000×g離心3min，轉移上清液至一新離心管中。上清液中加入等體積16%的PEG8000溶液，振蕩混勻，冰上放置過夜；4℃、12000×g離心30min；棄上清液，用140μL 1×PBS緩沖液重懸浮沉淀；按照TIANamp病毒RNA提取試劑盒說明提取純化病毒RNA。

PGM-MB富集法：將樣品放入50mL離心管中，加入35mL ddH2O。多功能搖床室溫振蕩30min，4℃、3000×g離心3min，轉移上清至一新離心管。上清中加入15mL CBS緩沖液，顛倒混勻后加入100μL PGM-MB；室溫、低速振蕩30min，磁力分離架上靜置30min；轉移磁珠至1.5mL離心管，用1mL 1×PBS緩沖液清洗3次后，用140μL 1×PBS緩沖液重懸浮磁珠；95℃ 5min熱釋放病毒；4℃，磁力分離架上靜置5min；轉移上清液，按照TIANamp病毒RNA提取試劑盒說明提取純化病毒RNA。

1.3.5 反轉錄與實時熒光RT-PCR擴增

反轉錄體系為10μL，包括2μL 5×RT Master Mix、3μL RNase Free ddH2O、5μL RNA溶液。反應條件為：37℃，15min；85℃，5s。實時熒光RT-PCR反應的引物探針序列分別為：COG2F[15]：5′-CARGARBC NATGTTYAGRTGGATGAG-3′；COG2R：5′-TCGACGCCATCT TCATTCACA-3′；G2P：5′-FAMTGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ1-3′。實時熒光RTPCR反應體系為20μL，包括1×Premix ExTaq，上下游引物各為0.2μmol/L，探針為0.15μmol/L，1×ROX熒光染料，2μL病毒cDNA溶液。擴增條件為：95℃、30s，95℃、5s，60℃、31s；45個循環。

2 結果與分析

2.1 兩種富集方法回收率的比較

2.1.1 RTU的確定和標準曲線繪制

回收率是評定檢測方法的一個重要指標，要比較各富集方法的回收率，首先需要確定接種與回收的病毒量。由于諾如病毒還不能在細胞或組織中培養，本研究以RTU表示諾如病毒量，以每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數(Ct)值為縱坐標、lg(RTU)為橫坐標建立標準曲線。根據標準曲線的轉換可得到EG8000富集方法和PGM-MB富集方法回收的病毒量，進而計算并比較回收率。

梯度稀釋病毒原液至稀釋倍數10-3、10-4、10-5、4×10-6、2×10-6、10-6，提取病毒RNA，反轉錄，實時熒光RT-PCR擴增。稀釋倍數為2×10-6的病毒懸浮液有擴增，但不能全部檢出，且Ct值不穩定；稀釋倍數為4×10-6病毒懸浮液經3次重復實驗均能穩定檢出，認為4×10-6為可穩定檢出的最高稀釋倍數，因此定義140μL稀釋倍數為4×10-6的病毒懸浮液為1RTU，則140μL的病毒原液中含有的病毒量為2.5×105RTU。以140μL病毒稀釋倍數為4×10-2、4×10-3、4×10-4、4×10-5、4 × 10-6(分別對應104、103、102、10RTU 和1RTU)的病毒懸浮液繪制的標準曲線(圖1)。擴增效率E值為0.864，相關系數R2為0.999。

2.1.2 回收率的比較

2.1.2.1 以青蔥為基質時回收率的比較

為比較以青蔥為基質時PEG8000與PGM-MB富集的回收率，選擇14μL稀釋倍數為2.5×10-2、5×10-3、1×10-3(對應的病毒量分別為625、125、25RTU)的諾如病毒懸浮液接種于青蔥表面。在這3個接種量條件下，PEG8000與PGM-MB富集均能穩定檢出(表1)。

表1 以青蔥為基質時PEG8000和PGM-MB方法富集回收率的比較(±s,n＝3)Table 1 Recovery rates of viruses from inoculated green onions by PEG8000 and PGM-MB methods (±s,n＝3)

表1 以青蔥為基質時PEG8000和PGM-MB方法富集回收率的比較(±s,n＝3)Table 1 Recovery rates of viruses from inoculated green onions by PEG8000 and PGM-MB methods (±s,n＝3)

注：t-檢驗中P＞0.05，表明兩組數據無顯著差異；P＜0.05表明有差異顯著。下同。

稀釋倍數/接種量 處理 Ct值/RTU值 回收率/%2.5×10-2/625RTU PEG8000 33.54±0.39/32.86±7.57 5.26±1.21 PGM-MB 33.88±0.53/27.03±8.44 4.32±0.77( P＝0.425)5×10-3/125RTU PEG8000 36.60±0.15/4.83±0.47 3.86±0.38 PGM-MB 36.70±0.17 /4.54±0.47 3.63±0.38 (P＝0.499)1×10-3/25RTU PEG8000 40.28±0.15/0.49±0.04 1.93±0.18 PGM-MB 38.95±0.28 /1.12±0.20 4.49±0.79 (P＝0.005)

由表1可知，接種量為625RTU時，PEG8000富集和PGM-MB富集的平均回收率分別為5.26%、4.32%；接種量為125RTU時，PEG8000富集和PGM-MB富集的平均回收率分別為3.86%、3.63%。接種量分別為625、125 RTU時，P值分別為0.425、0.499。接種量為25RTU時，PEG8000和PGM-MB富集的平均回收率分別為1.93%、4.49%，P值為0.005。

2.1.2.2 以葡萄為基質時回收率的比較

同樣選擇14μL稀釋倍數為2.5×10-2、5×10-3、1×10-3(對應病毒量分別為625、125、25RTU)的諾如病毒懸浮液接種于葡萄表面。在這3個接種量條件下，PEG8000與PGM-MB富集的3次重復均能穩定檢出(表2)。

由表2可知，接種的病毒量為625、125RTU與25RTU時，PEG8000的平均回收率分別為7.88%、5.27%和5.11%，PGM-MB的平均回收率分別為46.47%、31.95%和16.40%，PGM-MB的平均回收率均高于PEG8000；t檢驗的P值分別為P＜0.001、P＝0.003和P＜0.001。

表2 以葡萄為基質時PEG8000和PGM-MB方法富集回收率的比較Table 2 Recovery rates of viruses from inoculated grapes by PEG8000 and PGM-MB methods

2.2 兩種富集方法檢測下限的比較

2.2.1 以青蔥為基質的比較

為比較PEG8000與PGM-MB富集方法的檢測下限，選擇14μL稀釋倍數為1×10-3、2×10-4、4×10-5、8×10-6(對應病毒量分別為25、5、1、0.2RTU)的病毒懸浮液接種于青蔥表面，設3次重復。4個接種量下，PEG800富集可檢測到25RTU，3次重復均能檢出(表3)；PGM-MB富集可檢測到5RTU，檢出情況為3次重復檢出2次。

表3 以青蔥為基質的檢測下限比較Table 3 Detection limit of viruses for inoculated green onions by PEG8000 and PGM-MB methods

2.2.2 以葡萄為基質的比較

同樣選擇14μL稀釋倍數為1×10-3、2×10-4、4×10-5、8×10-6(對應病毒量分別為25、5、1、0.2RTU)的諾如病毒懸浮液接種于葡萄表面，設3次重復。由表4可知，PEG8000富集可檢測到5RTU，檢出情況為3次重復檢出2次；PGM-MB富集可檢測到1RTU，檢出情況為3次，重復檢出1次。

表4 以葡萄為基質的檢測下限比較Table 4 Detection limit of viruses for inoculated grapes by PEG8000 and PGM-MB methods

3 討 論

病毒的富集是檢測食品基質中諾如病毒的一個關鍵步驟，本研究對PEG8000沉淀和PGM-MB的優缺點進行了比較。研究表明：基質為青蔥時，在低濃度的病毒接種量條件下， PGM-MB富集的檢測下限更低，其回收率也顯著高于PEG8000富集；基質為葡萄時，PGMMB富集的回收率均顯著高于PEG8000富集，且檢測下限更低。由于食品基質中的諾如病毒污染水平往往很低，因此，檢測下限越低的方法越能更好的保障食品安全。通過比較研究，認為PGM-MB富集法更適合應用于青蔥、葡萄中諾如病毒的檢測。

Guevremont等[16]用PEG8000富集法對青蔥中諾如病毒的檢測進行了研究，其采用的洗脫緩沖液為含有磷酸鹽肉湯的甘氨酸緩沖液，RNA提取法為TRIzol裂解法，接種量為100RTU時，可穩定檢出，對于接種量為1、10RTU的樣品可部分檢出，該研究沒有進行病毒回收率的研究；本研究中，青蔥的病毒接種量為25RTU以上時，PEG8000和PGM-MB富集法均能穩定檢出，PGMMB方法的檢測下限更低，可部分檢測到5RTU接種病毒量。

Kim等[17]用PEG8000富集法對葡萄中諾如病毒的檢測進行了研究，其研究結果表明，采用PEG8000富集時，葡萄基質中諾如病毒的回收率為2.6%～19.7%(平均值為8.05%)。本研究中，PEG8000富集葡萄基質中諾如病毒的回收率為5.11%～7.88%(平均值為6.09%)，與 Kim等[11]的研究結果相當；而本研究采用的PGM-MB富集方法，回收率為16.40%～46.47%(平均值為31.61%)，遠高于Kim等報道和本研究報道的PEG8000富集方法。

本研究應用PGM-MB富集檢測青蔥、葡萄中的諾如病毒，除了其回收率和檢測下限整體優于PEG8000方法外，PGM-MB方法最大的優勢是節省時間。PEG8000富集法多為過夜富集，具有耗時較長、步驟較多、操作麻煩等缺點，包括RT-PCR檢測時間在內，耗時在24h以上；而利用PGM-MB富集檢測可在4～6h內完成，能快速檢測食品基質中的諾如病毒，該方法簡便快捷，能有效的去除RT-PCR反應抑制因子。因此，PGM-MB作為一種新的諾如病毒富集方法適用于水果、蔬菜樣品的諾如病毒富集檢測。

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Comparative Detection of Human Noroviruses in Green Onion and Grape Using Porcine Gastric Mucin-Conjugated Magnetic Beads and Polyethylene Glycol Enrichment

ZHANG Qi-gang1,2，PAN Liang-wen1,*，LI Xiang1，FANG Yun1，TIAN Peng3
(1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shangha 200135, China；2. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；3. Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Albany, CA 94710, USA)

Objective: To establish and compare two detection methods for human norovirus (HuNoV) in fruit (grape) and vegetable (green onion) samples using porcine gastric mucin-conjugated magnetic beads (PGM-MB) and polyethylene glycol 8000 (PEG8000), respectively. Methods: 1 RTU was defined from a consistently (triplicate) positive qRT-PCR signal of viral RNA extract with 4 × 10-6dilution. A standard curve (1 to 10000 RTU) was established to convert Ct values to corresponding RTUs with an equation ofy(Ct) = －3.6967 lg (RTU) ＋39.12 withR2of 0.999. Green onion and grape samples were inoculated with various amounts of HuNoV, eluted and concentrated using PGM-MB or PEG8000 method. Viral RNA was extracted and quantified by qRT-PCR. Student,st-test was used for statistical analysis. Results: The virus recovery rate by PGM-MB method((31.61 ± 15.04)%) was significantly higher than that obtained by PEG precipitation method ((6.09 ± 1.56)%) at all doses of HuNoV inoculated onto grapes (P＜0.001). For virus-inoculated green onions, the virus recovery rates from higher inoculation doses (625 RTU and 125 RTU) were comparable between both methods. However, the virus recovery rate by PGM-MB method from a lower dose of HuNoV (25 RTU) inoculated onto green onion samples was significant higher ((4.49± 0.79)%) than that from PEG precipitation method ((1.93 ± 0.18)%). In addition, PGM-MB method showed a lower detection limit than PEG precipitation method. Conclusion: PGM-MB method requires less time than PEG precipitation method, produces higher yieldof HuNoV from various food samples, and hence exhibits higher sensitivity.

norovirus；porcine gastric mucin-conjugated magnetic beads；polyethylene glycol 8000；real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

2011-10-25

國家質檢總局科技計劃項目(2010IK147)

張其剛(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為生物化學分子生物學。E-mail：zqghy2004@126.com

*通信作者：潘良文(1966—)，男，研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：panlw888@126.com

TS201.6；R155.5

A

1002-6630(2012)16-0241-05