氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分

李辛雷，孫振元*，李紀(jì)元，范正琪，殷恒福

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；

2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分

李辛雷1,2，孫振元2,*，李紀(jì)元1，范正琪1，殷恒福1

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；

2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

采用固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析杜鵑紅山茶花朵不同花期、不同部位和一天中不同時間段的揮發(fā)性成分及其相對含量，并對其變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：杜鵑紅山茶花蕾期的揮發(fā)性成分有8種、始花期20種、盛花期21種、衰落期17種，其中始花期和盛花期為揮發(fā)性成分釋放的主要時期；花朵開放過程中，醇類化合物的相對含量逐漸升高，烯類、酯類和烷烴類先升高后降低，醛酮類總體呈下降趨勢。杜鵑紅山茶盛花期花朵的4個部位中，萼片的揮發(fā)性成分有20種，花瓣22種、雄蕊21種、雌蕊13種，其中花瓣和雄蕊為揮發(fā)性成分釋放的主要部位；花瓣、雄蕊、萼片中烷烴類相對含量均最高，分別占揮發(fā)性成分總量的49.86%、51.59%和44.66%；雌蕊中醛酮類含量最高，為83.87%。揮發(fā)性成分的相對含量在一天中變化明顯，8:00時到12:00時是烯類、醇類、酯類和烷烴類化合物釋放的高峰期，而醛酮類在14:00時到18:00時的釋放量較高。

杜鵑紅山茶；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

山茶(Camellia)原產(chǎn)于我國，是我國十大傳統(tǒng)名花之一[1]。山茶花除具有觀賞價值，還具有食用和藥用功能，我國山茶花栽培應(yīng)用歷史悠久，其觀賞性、食用性和藥用性已為相關(guān)資料所證實[2-4]。已有研究表明山茶花中主要有益成分包括糖類、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、氨基酸、黃酮類等[3,5]，具有抗菌、抗氧化、降血壓和調(diào)節(jié)血脂含量等作用[4]。目前，在山茶花食用價值的利用方面，已開發(fā)出金花茶(C. nitidissima)茶用飲料及食品[3]。

觀賞植物玫瑰(Rosa rugosa)、白蘭花(Michelia alba)及茉莉花(Jasminum sambac)等茶用植物香氣成分的研究表明，香氣的產(chǎn)生主要由于醇類、烯類、酯類和烷烴類等揮發(fā)性成分的存在[6-12]。在山茶花香氣成分研究方面，范正琪等[13-14]對3種山茶花揮發(fā)性成分進(jìn)行了測定。杜鵑紅山茶(C.azalea Wei)又名張氏紅山茶，不同于現(xiàn)有茶花品種僅在冬春季節(jié)開花的特性，杜鵑紅山茶花期長，為4～12月，且在適宜的栽培條件下，一年四季都可以開花[4]，是提取山茶花揮發(fā)性成分的良好材料，可用于開發(fā)山茶花香精香料及茶用飲料等食品產(chǎn)業(yè)，但目前關(guān)于其揮發(fā)性成分的研究尚未見相關(guān)報道。因此，本實驗利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)技術(shù)對杜鵑紅山茶不同花期、花朵不同部位和一天中不同時間段的揮發(fā)性成分及其相對含量進(jìn)行分析，研究杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，以期為山茶花食用價值的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杜鵑紅山茶花朵，采集于中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所苗圃，采樣時間為2011年7月。杜鵑紅山茶的花期劃分為4個階段，即花蕾期、始花期、盛花期和衰落期，花蕾期指大部分花蕾完全伸出苞葉，花蕾顏色已變紅；始花期指花瓣微展，雄蕊被包裹在花瓣中；盛花期指花瓣完全張開，花藥已發(fā)育成熟；衰老期指花瓣出現(xiàn)褶皺，質(zhì)地開始變薄。杜鵑紅山茶盛花期的花朵分為4個部位，即萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊。以一天中8:00(T1)、10:00(T2)、12:00(T3)、14:00(T4)、16:00(T5)、18:00(T6)的揮發(fā)性成分含量的變化來表示杜鵑紅山茶花朵揮發(fā)性成分的日變化。同種環(huán)境條件下每個處理選取5株，每株重復(fù)采樣3次，采后30min內(nèi)進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的測定。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25μm) 美國Agilent公司；PDMS/DVB萃取頭(65μm) 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分提取

將采集的樣品置于頂空樣品瓶中，加入0.5μL 40ng/μL癸酸乙酯溶液作為內(nèi)標(biāo)物，采用固相微萃取法，40℃條件下，65μm PDMS/DVB萃取頭萃取30min進(jìn)樣。

1.3.2 GC-MS條件

電離方式為電子電離(electron ionization，EI)，電子能量70eV，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫35℃保持2min，以5℃/min升至80℃，再以8℃/min升至180℃，再以8℃/min升至250℃；四極桿溫度150℃、離子源溫度230℃、接口溫度為280℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍為30～500u。

1.3.3 揮發(fā)性成分定性和定量分析

揮發(fā)性成分根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和氣質(zhì)聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果定性；各組分的相對含量根據(jù)各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜鵑紅山茶不同花期揮發(fā)性成分

從表1可以看出，花蕾期的揮發(fā)性成分為8種、始花期20種、盛花期21種、衰落期17種。揮發(fā)性成分中辛烷、壬醛、石竹烯、萘和羅漢柏烯等5種化合物的相對含量高于其他成分，且隨花朵的開放呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，其主要含量集中于始花期和盛花期；5種化合物含量合計占始花期中總揮發(fā)性成分的65.92%、盛花期的61.02%，為主要揮發(fā)性化合物。羅漢柏烯、柯巴烯、萘、3-苯基-2-丙烯醛和1,2,3,4,5-五甲基-1,3-環(huán)戊二烯僅在始花期和盛花期存在；α-雪松烯僅在始花期存在。杜鵑紅山茶花蕾期甲醚、2-丙烯醛的相對含量較高，隨花朵開放其相對含量逐漸下降。除辛烷、壬醛外，杜鵑紅山茶衰落期2-{4-[2-(4-甲氧基甲苯基)乙烯基]苯基}丙-2-醇的相對含量較高，且其含量隨花朵的開放呈逐漸升高的趨勢。

圖1 杜鵑紅山茶不同花期的主要揮發(fā)性成分分類Fig.1 Relative contents of major groups of volatile components at different flowering stages of C. azalea

杜鵑紅山茶不同花期的揮發(fā)性成分劃分為6類化合物，即烯類、醇類、醛酮類、酯類、烷烴類和其他(主要包括甲醚、酸類化合物和胺類化合物)。由圖1可知，6類化合物中烯類相對含量最高，其次為烷烴類和醛酮類，3者分別占總揮發(fā)性成分的44.17%、16.42%和16.38%；醇類和酯類分別占9.08%和4.50%。花朵開放過程中，烯類、酯類和烷烴類化合物相對含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其始花期和盛花期含量合計分別占不同花期總含量的89.16%、81.09%和62.62%。醇類隨花朵開放其相對含量逐漸升高，始花期和盛花期的含量合計占56.89%；醛酮類相對含量總體呈逐漸下降的趨勢，始花期和盛花期的含量合計占40.96%。

表1 杜鵑紅山茶不同花期的主要揮發(fā)性成分及其相對含量Table 1 Major volatile components and relative contents at different flowering stages of C. azalea

表2 杜鵑紅山茶花朵不同部位主要揮發(fā)性成分及其相對含量Table 2 Major volatile components and relative contents in different parts of C. azalea flowers

續(xù)表2

2.2 杜鵑紅山茶花朵不同部位的揮發(fā)性成分

由表2可以看出，盛花期杜鵑紅山茶萼片的揮發(fā)性成分20種、花瓣22種、雄蕊21種、雌蕊13種，與花瓣和雄蕊相比，萼片和雌蕊揮發(fā)性成分的組成較為簡單，相對含量也較低，說明花瓣和雄蕊是杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分釋放的主要部位。杜鵑紅山茶花朵4個部位含有7種相同的化合物，且各成分在花瓣、雄蕊中的相對含量遠(yuǎn)高于萼片和雌蕊，如正己烷在花瓣、雄蕊中分別為9.3435%和6.6015%，而萼片、雌蕊中為2.1732%和0%。花瓣中正己烷的相對含量最高，其次是鄰苯二甲酸酯、2-乙基-1-己醇和2-甲基丁烷，這幾種化合物相對含量之和占花瓣揮發(fā)性成分總含量的65.30%，為杜鵑紅山茶花瓣的主要揮發(fā)性成分。雄蕊中正己烷、2,2, 4-三甲基-戊烷、壬醛和2-(4-乙氧基碳基)苯亞甲基-苯并呋喃-6-醇-3-酮占雄蕊揮發(fā)性成分總含量的58.42%，為雄蕊的主要揮發(fā)性成分。

如圖2所示，6類化合物中烷烴類相對含量最高，其次為醛酮類、醇類和烯類，分別占總揮發(fā)性成分的48.21%、17.93%、13.12%和12.22%。花瓣中烷烴類相對含量最高，占花瓣中揮發(fā)性成分總量的49.86%，其次為醇類、烯類和酯類；雄蕊、萼片中烷烴類相對含量亦最高，分別占揮發(fā)性成分總量的51.59%和44.66%，其次為醛酮類、烯類和醇類；雌蕊中醛酮類相對含量最高，占揮發(fā)性成分總量的83.87%，其余化合物含量均較低。

圖2 杜鵑紅山茶花朵不同部位的主要揮發(fā)性成分分類Fig.2 Relative contents of major groups of volatile components in different parts of C. azalea flowers

2.3 杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分的日變化

如表3所示，庚醛、α-蒎烯、(E)-3-甲基-1,3-戊二烯、2-乙基-1-己醇、3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙基)-芴-9-醇、4-乙基苯氧酸-2-丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和己烷等化合物的相對含量高于其他成分，為主要揮發(fā)性成分。揮發(fā)性成分的相對含量在一天中變化較大，其中庚醛相對含量在一天中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，高峰期集中在16:00時到18:00時；α-蒎烯和(E)-3-甲基-1,3-戊二烯呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其峰期分別出現(xiàn)在10:00和12:00時；4-乙基苯氧酸-2-丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和己烷峰期均出現(xiàn)在8:00時；2-乙基-1-己醇呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，高峰期集中在10:00時到12:00時；3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙基)-芴-9-醇呈現(xiàn)降低升高再降低的趨勢，高峰期集中在8:00時到10:00時。

由圖3可知，杜鵑紅山茶主要揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量及其相對含量的日變化為：揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量方面，烯類化合物的組分?jǐn)?shù)量最多，且從8:00時到12:00時逐漸升高，然后降低，14:00時后穩(wěn)定不變；醇類在一天中比較穩(wěn)定，無明顯變化；醛酮類組分?jǐn)?shù)量8:00時到12:00時逐漸降低，14:00時到18:00時呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢；酯類和烷烴類化合物的組分較少，在某些時段未能檢測到。在主要揮發(fā)性成分相對含量方面，醛酮類最高，其次為烯類、醇類和酯類，烷烴類較低；醛酮類化合物在一天中呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，14:00時到18:00時為其相對含量的高峰期，占揮發(fā)性成分的大部分；烯類、醇類化合物在一天中呈現(xiàn)升高降低再升高降低的雙峰曲線，8:00時到12:00時占揮發(fā)性成分的大部分，10:00時和16:00時出現(xiàn)2個峰值；酯類和烷烴類化合物呈現(xiàn)降低升高再降低的趨勢，8:00時到12:00時占揮發(fā)性成分的絕大部分。可見，一天中8:00時到12:00時，是烯、醇、酯類和烷烴類化合物釋放的高峰期，14:00時到18:00時是醛酮類化合物釋放的高峰期。

表3 杜鵑紅山茶主要揮發(fā)性成分及其相對含量的日變化Table 3 Diurnal variations of major volatile components and relative contents in C. azalea flowers

圖3 杜鵑紅山茶主要揮發(fā)成分及其相對含量的日變化Fig.3 Diurnal variation of major groups of volatile components and relative contents in C. azalea flowers

3 討 論

范正琪等[13-14]對山茶物種攸縣油茶(C. grijsii)及品種‘克瑞墨大牡丹’和‘香神’的研究表明，香氣成分以醇、醛、酯、烯、烷及芳樟醇氧化物為主，其中攸縣油茶以順-芳樟醇氧化物Ⅱ和苯乙醇占優(yōu)勢，‘克瑞墨大牡丹’芳樟醇相對含量較高，‘香神’以壬醛和芳樟醇含量最高。本實驗中杜鵑紅山茶主要揮發(fā)性成分不完全相同，且主要成分相對含量差異較大，這可能與物種或者物種特異成分的組成不同有關(guān)。已有研究認(rèn)為臘梅(Chimonanthus praecox)釋香過程中烷烴、醇類和酯類物質(zhì)的含量與臘梅的開放度呈正相關(guān)[15]；茉莉花采后的未成熟期、成熟期和枯萎期醇類物質(zhì)含量與茉莉花采后的存放時間呈正相關(guān)，酯類物質(zhì)在成熟期的含量最高[16]。杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分隨著花朵的開放而逐漸形成并釋放，從花蕾期到盛花期，醇類、酯類和烷烴類化合物的相對含量總體呈上升趨勢，這與臘梅和茉莉的研究報道基本相符[15-16]，但醛酮類化合物在花朵開放過程中總體上有逐漸下降的趨勢，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

對杜鵑紅山茶花朵不同部位揮發(fā)性成分的分析發(fā)現(xiàn)，花瓣和雄蕊是揮發(fā)性成分釋放的主要部位，但不同部位揮發(fā)性成分的組分存在一定差異，即使相同成分在不同部位中的含量亦差異明顯，說明植物不同部位揮發(fā)性成分及其相對含量不盡相同[17]。杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分的相對含量在一天中變化明顯，醇類物質(zhì)中大部分成分如2-乙基-1-己醇、4-戊烯-2-醇、(E)-2-己烯-1-醇和3-甲基-2-己醇等在10:00時的釋放量最大，在18:00時釋放量較小，這與李海東等[18]對珍珠梅(Sorbaria kirilowii)揮發(fā)性物質(zhì)中醇類日動態(tài)變化的研究基本一致，但本實驗醛酮類和酯類物質(zhì)的釋放強度則與其研究結(jié)果不盡相同，說明同種物質(zhì)在一天中的釋放強度不僅受環(huán)境因子的影響，還與實驗材料的特性相關(guān)。

杜鵑紅茶花期長，原料豐富，花中的揮發(fā)油能用于化妝品、香精香料及茶用飲料等，是開發(fā)山茶花揮發(fā)性物質(zhì)的良好材料。本實驗利用固相微萃取結(jié)合GCMS技術(shù)對杜鵑紅山茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，明確了杜鵑紅山茶揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。但植物揮發(fā)性成分形成及釋放的機理比較復(fù)雜，杜鵑紅山茶主要揮發(fā)性化合物的具體來源途徑，相關(guān)酶活性的變化及其與揮發(fā)性成分釋放的關(guān)系等還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

杜鵑紅山茶不同花期中，始花期和盛花期為揮發(fā)性成分釋放的主要時期，辛烷、壬醛、石竹烯、萘和羅漢柏烯等化合物是杜鵑紅山茶的主要揮發(fā)性成分。在花朵不同部位中，花瓣和雄蕊是揮發(fā)性成分釋放的主要部位，己烷、2-甲基丁烷、2-乙基-1-己醇和鄰苯二甲酸酯為花瓣的主要揮發(fā)揮發(fā)性成分，己烷、2,2,4-三甲基-戊烷、2-甲基丁烷、羅漢柏烯、2-(4-乙氧基碳基)苯亞甲基-苯并呋喃-6-醇-3-酮和壬醛為雄蕊的主要揮發(fā)性成分。揮發(fā)性成分的相對含量在一天中變化明顯，8:00時到12:00時是烯類、醇類、酯類和烷烴類化合物釋放的高峰期，而醛酮類化合物在14:00時到18:00時的釋放量較高。

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GC-MS Analysis of Volatile Components in Camellia azalea Flowers

LI Xin-lei1,2，SUN Zhen-yuan2,*，LI Ji-yuan1，F(xiàn)AN Zheng-qi1，YIN Heng-fu1

(1. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China；2. State Key
Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

Volatile compounds in Camellia azalea flowers at different stages during flower development, in their different parts and at different hours of a day were analyzed by solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (GCMS). Totally 8, 20, 21 and 17 volatile compounds were identified in early-stage, full bloom and withering flowers, respectively. Volatile compounds were released mainly during the early flowering and full bloom stages. During flower development, the content of alcohols revealed a gradual increase. Alkenes, esters and alkanes revealed an initial increase and a final decrease, while aldehydes and ketones revealed a decrease trend during the whole process. Totally 20 compounds were identified in sepals, 22 in petals, 21 in stamens and 13 in pistils. The major parts releasing volatile components were petals and stamens. Alkanes were the most dominant volatile compounds in sepals, stamens and petals, accounting for 49.86%, 51.59% and 44.66% of the total volatiles, respectively, while the most dominant volatile compounds in pistils were aldehydes and ketones with a relative content of 83.87%. An obvious intraday variation was observed in the relative contents of volatile compounds in Camellia azalea flowers. The peak hours for releasing alkenes, alcohols, esters and alkanes were 8:00 to 12:00, while higher release levels of aldehydes and ketones were found from 14:00 to 18:00.

Camellia azalea；volatile component；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS207.3

A

1002-6630(2012)16-0130-07

2011-12-21

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(30800886)；浙江省科技計劃項目(2010C32038)

李辛雷(1978—)，男，助理研究員，博士，研究方向為觀賞植物遺傳育種與應(yīng)用。E-mail：lixinlei2020@163.com

*通信作者：孫振元(1964—)，男，研究員，博士，研究方向為園林植物分子育種。E-mail：sunzy@263.net