蘆筍水解氨基酸的測定

姜云云， 葉光明*， 范國榮， 陳云紅， 潘小明， 沐 韋

（1.中國人民解放軍第101醫院，江蘇 無錫 214044；2.第二軍醫大學藥物分析教研室，上海 200433）

蘆筍Asparagus officinalis L.為百合科天門冬屬植物，學名石刁柏，又名蘆荀、龍須菜、細百葉部等。現代研究表明蘆筍具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、降血脂等活性，是理想的綠色保健食品［1-3］。蘆筍中含有豐富的多糖、黃酮、氨基酸等活性成分，是蘆筍發揮藥理藥效的物質基礎。

目前對蘆筍氨基酸的研究已有相關文獻報道，安玉會等［4］采用氨基酸自動分析儀對蘆筍口服液中的氨基酸進行了分析，所用儀器昂貴、測定成本較高，不適合推廣應用；邵旭等［5］用柱前衍生HPLC法測定了蘆筍中的門冬氨酸，該方法采用了專門的氨基酸分析柱，且只測定了一種氨基酸，不能系統評價蘆筍中氨基酸的分布。本實驗采用柱前衍生化法測定蘆筍中的11種氨基酸，所用方法簡單易行、測定結果準確，且無需特殊設備，該法可用于蘆筍氨基酸成分的質量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 島津LC-10A系列高效液相色譜儀，包括 LC-10ATvp泵，SCL-10Avp系統控制器，SIL-10ADvp自動進樣器，CTO-10ASvp柱溫箱，SPD-10vp紫外檢測器，工作站為島津 CLASS-VP。SK7200H超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)，HA-202M 電子天平(A＆D Company LTD.)。

1.2 試藥 氨基酸標準品(BDH Chemical LTD，Poole England)，衍生化試劑6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯 (AQC)及緩沖液(Waters公司)，乙腈為色譜純(克萊頓，加拿大)，磷酸和三乙胺為分析純(上海化學試劑有限公司)，水為自制去離子水(18.2 MΩ)。蘆筍鮮品購于當地超市，產地福建，經第二軍醫大學藥學院生藥教研室張巧艷教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液配制 分別稱取組氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸適量，用0.1 mol/L鹽酸配成質量濃度均為1 mg/mL的混合標準品貯備液。該貯備液再用水稀釋成含上述各氨基酸均為20 μg/mL的混合標準對照溶液，即得。

2.2 供試品溶液的配制 稱取新鮮蘆筍勻漿液0.8 g置5 mL量瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液至刻度，混勻，將該混懸液移至安瓿瓶中，用氮氣將安瓿瓶中的空氣趕凈，封口，于110℃放置24 h水解，取水解液 1 mL于 10 mL量瓶中，加入1.2 mol/L NaOH溶液5 mL，混勻，并用水定容至刻度，經0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 氨基酸衍生化反應［6］精密吸取對照品溶液或供試品溶液50 μL于0.5 mL離心管中，加入350 μL緩沖液，渦旋10 s，再加入100 μL衍生化試劑，渦旋10 s，于55℃烘箱中放置10 min，取出冷至室溫，于4℃冰箱保存待測。

2.4 色譜條件 Diamonsil?(鉆石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)(Dikma Technologies)；采用梯度洗脫，流動相 A為磷酸-三乙胺-水(0.3∶0.5∶100)，流動相B為乙腈-水(60∶40)，洗脫程序見表1；檢測波長248 nm；柱溫37℃；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min。

表1 流動相梯度程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.5 專屬性試驗 以水代替蘆筍勻漿液按2.2項下制備空白樣品液，按2.3項下進行衍生化反應，在上述色譜條件下進樣，結果見圖1?？瞻讟悠芬簩Υ郎y氨基酸的分離沒有干擾，方法專屬性良好。

2.6 線性考察 配制系列質量濃度的混合氨基酸標準溶液，分別衍生化反應后進高效液相色譜儀檢測，記錄各氨基酸衍生化產物的色譜峰面積，與各自質量濃度進行線性回歸，結果見表2。

2.7 精密度試驗 取對照品溶液，衍生化反應后連續進樣5次，記錄各氨基酸衍生化產物的色譜峰面積值，結果各氨基酸的RSD值均小于1.5%。

2.8 重復性試驗 取同一批蘆筍樣品，按2.2項下平行制備5份樣品溶液，衍生化反應后分別進高效液相色譜儀檢測，記錄各氨基酸衍生化產物色譜峰面積值并計算質量分數，結果各氨基酸的RSD值均小于3.0%。

2.9 穩定性試驗 取蘆筍勻漿液，按2.2項下制備供試品溶液，衍生化反應后分別于 0、1、2、4、6、8 h檢測，記錄各氨基酸衍生化產物色譜峰面積值，結果各氨基酸的RSD值均小于1.5%，表明樣品在衍生化反應后8 h內穩定。

2.10 回收率試驗 采用加樣回收試驗。取6份已知氨基酸質量分數的蘆筍勻漿液，各加入對照品溶液適量，按2.2項下處理并進行衍生化反應，進高效液相色譜儀檢測，計算回收率，結果見表3。

2.11 樣品測定 取10批蘆筍樣品，按2.2項下配制供試品溶液，測定其中11種氨基酸，結果如下:組氨酸2.97‰ ～5.56‰，甘氨酸0.39‰ ～0.53‰，天冬氨酸1.64‰ ～3.63‰，谷氨酸0.89～1.55‰，蘇氨酸0.32‰ ～0.46‰，丙氨酸0.32‰ ～0.57‰，胱氨酸0.47‰ ～1.01‰，酪氨酸0.23‰ ～0.28‰，纈氨酸0.36‰ ～0.65‰，亮氨酸0.37‰ ～0.60‰，苯丙氨酸0.35‰～0.44‰。

圖1 蘆筍氨基酸的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids in Asparagus officinalis L

表2 11種氨基酸的線性考察Tab.2 Linearity test of 11 amino acids

表3 回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery test

3 討論

氨基酸是廣泛存在于植物體內的一種含氮物質，是構成生物體蛋白質分子的基本單位，也是蛋白質消化后的最終產物，在生物體內具有特殊的生理功能，對人體疾病治療和保健具有重要價值。蘆筍中的氨基酸成分比較豐富，品種齊全，富含必需氨基酸和藥效氨基酸，具有很高的營養價值和保健作用［7］。

氨基酸的測定方法較多，其中，氨基酸分析儀雖然操作簡便，但價格昂貴，使用成本高，不適合普及［8-10］。柱前衍生化法目前應用較為廣泛，衍生化試劑品種繁多［11-12］，本實驗采用的HPLC-AccQ-Tag法是Waters公司專為柱前衍生高效液相分析氨基酸而開發的創新方法。其核心在于名為AQC的專利衍生劑能與所有含氨基的化合物發生快速、定量反應，過量的AQC可在1 min內水解為不干擾測定的AMQ，生成的衍生物穩定。Waters公司為該法配備了專門的氨基酸分析柱和相應的流動相洗脫程序，但考慮到氨基酸分析柱價格昂貴，適用范圍窄等缺點，本實驗采用普通的C18柱進行分離，所用流動相也作了相應調整，結果也能獲得較為滿意的分離效果，使得該法具有更強的適用性。

［1］李鳳琴，張大錘，曲顯俊，等.蘆筍提取物抗癌作用的研究［J］.癌 癥，1993，12(3):200-202.

［2］苗明三，顧麗亞，方曉燕，等.蘆筍多糖對衰老模型小鼠的影響［J］.中國中藥雜志，2004，29(7):673-675.

［3］Zhu X L，Zhang W，Zhao J J，et al.Hypolipidaemic and hepatoprotective effects of ethanolic and aqueous extracts from Asparagus officinalis L.by-products in mice fed a high-fat diet［J］.J Agric Food Chem，2010，90(7):1129-1135.

［4］安玉會，吳鐵漢，鄭香梅，等.蘆筍口服液中氨基酸含量分析［J］.河南醫科大學學報，1998，33(4):12-14.

［5］邵 旭，牛海軍，李曉亮，等.柱前衍生RP－HPLC法測定蘆筍中門冬氨酸的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15(1):8-10.

［6］姜云云，范國榮，葉光明.海墨止血片的質量標準研究［J］.中成藥，2006，28(6):798-801.

［7］周利亙，王春輝，王君虹，等.蘆筍的活性成分及其生物學功能［J］.安徽農業通報，2006，12(2):23-25，116.

［8］楊 芳，邵金良，汪慶平，等.美洲大蠊水解氨基酸含量測定及營養評價［J］.氨基酸和生物資源，2010，32(1):9－11.

［9］曾琦斐.中藥黨參中微量元素與氨基酸含量的測定［J］.中國醫藥導報，2010，7(19):65-66.

［10］孫偉娜，王繼彥.人參果肉的氨基酸成分分析［J］.長春中醫藥大學學報，2009，25(1):25-26.

［11］何新榮，劉 萍.高效液相-熒光檢測法測定烏靈膠囊中14種氨基酸的含量［J］.中成藥，2010，32(8):1358-1361.

［12］孫 蓮，張 煊，孟 磊，等.柱前衍生RP－HPLC法測定桑葉中16種游離氨基酸的含量［J］.中國藥房，2008，19(36):2830-2832.