HPLC法同時測定不同產地五味子中8種木脂素類成分

胡俊揚， 陸兔林， 毛春芹， 蘇 桃， 蔡寶昌

（南京中醫藥大學藥學院，南京中醫藥大學江蘇省針灸學結合重點實驗室，江蘇 南京 210046）

五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，是我國長期使用的補益類藥物。其味酸、甘，性溫。有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內熱消渴、心悸失眠等癥［1］。五味子中含有多糖、揮發油和木脂素類成分［2-4］，其中木脂素類成分與其具有抗肝臟損傷、抗氧化的作用明顯相關［5-7］。故木脂素的量直接影響五味子的質量及臨床應用，由于基因遺傳、生態環境、人工栽培、干燥程序、儲存條件等因素的影響，不同產地五味子中木脂素的含有量有所不同。東北三省地區一直被視為五味子的道地產地，有無科學道理，迄今未見系統報道。2010年版《中國藥典》以其中的五味子醇甲作為定量測定的指標，文獻報道測定多集中在五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素中的3種或5種［8-11］。本實驗建立了五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素8種木脂素的高效液相測定方法，并比較了不同產地五味子飲片中8種木脂素的含有量，為更好地控制五味子飲片及其制劑的內在質量提供了科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器、ChemStation工作站控制系統，KQ-500E型醫用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，電子天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 試藥 五味子醇甲(批號:110857-200709)、五味子醇乙(批號:110543-200708)、五味子酯甲(批號:111529-200503)、五味子甲素(批號:110764-200609)、五味子乙素(批號:110765-200710)，以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用；五味子丙素(批號:DR20101018)，購自上海鼎瑞化工有限公司，純度98%以上。戈米辛J(批號:10120821)和戈米辛G(批號:10120822)，購自上海同田生物科技有限公司，純度98%以上。五味子飲片購自安徽銅陵飲片廠，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定均為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實。甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～17 min，A 為50%；17～25 min，A為50% ～55%；25～30 min，A為55% ～75%；30～35 min，A 為75%；35～40 min，A 為75% ～65%；40～45 min，A為65% ～50%。體積流量1.0 mL/min。檢測波長217 nm，進樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)與五味子飲片(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances(A)and Schisandra chinensis(B)

2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子酯甲、戈米辛G、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素對照品適量，用甲醇溶解，配制成單一對照品貯備液。另精密吸取各單一對照品貯備液適量，配制成含五味子醇甲0.2502 mg/mL、戈米辛 J 0.0520 mg/mL、五味子醇乙0.1099 mg/mL、戈米辛 G 0.0255 mg/mL、五味子酯甲0.0379 mg/mL、五味子甲素0.0516 mg/mL、五味子乙素 0.2070 mg/mL、五味子丙素0.0456 mg/mL的混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取不同五味子飲片，粉碎，過三號篩，精密稱取約0.3 g，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲處理(功率250W，頻率20 kHz)20 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密吸取各質量濃度混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定。以峰面積對質量濃度進行線性回歸。回歸方程、線性范圍及相關系數見表1。

表1 8種木脂素成分的線性關系、回歸方程及相關系數Tab.1 Linear ranges and correlation of studied lignans

2.5 精密度試驗 將五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素質量濃度分別為125.10、26.00、54.95、12.75、18.95、25.70、103.50 和 22.80μg/mL的混合對照品溶液，按2.1項連續進樣5次，記錄各自峰面積，并計算其RSD值。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的RSD值分別為:0.14%、0.39%、0.34%、0.38%、0.43%、0.16%、0.11%和0.30%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取2.3項下的五味子(遼寧)粉末約0.3 g，共5份，按2.3項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進行HPLC分析。根據所得8種木脂素的峰面積計算其在樣品中的含有量。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均質量分數分別為8.0368、0.4607、1.5276、0.3412、0.4710、3.4370、3.7535和 0.4169 mg/g，RSD分別為 0.12%、0.76%、0.23%、0、92%、0.30%、0.10%、0.13% 和 0.73%，說明此方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一五味子樣品供試品溶液，室溫放置 0、4、8、12、24 h 后，按上述色譜條件進行HPLC分析，測定8種木脂素的峰面積。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素在不同時間峰面積的 RSD分別為0.28%、1.22%、0.90%、1.89%、1.17%、0.45%、0.38%和 1.22%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取8種對照品適量，置量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素質量濃度分別為 1.208、0.07、0.230、0.052 、0.07、0.52、0.56 和0.062 mg/mL的混合對照品溶液，備用。精密稱取已知8種木脂素含有量的五味子樣品約0.15 g，共9份。根據樣品中五味子醇甲含有量的80%、100%與120%，分別加入混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，按2.3項下方法制備成供試品溶液，按2.1項進行HPLC分析，根據測得量和加入量計算回收率。五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的加樣回收率(RSD)分別為99.75%(0.38%)、100.69%(2.31%)、100.46%(1.39%)、99.87%(1.15%)、100.22%(1.45%)、100.15%(0.99%)、100.61% (0.25%) 和 101.31%(1.03%)。符合定量測定要求，表明本法準確可靠。

2.9 樣品測定 取不同產地五味子飲片，粉碎，過三號篩，精密稱取約0.3 g，各3份。按照2.3項下制備成供試品溶液，按2.1項進行HPLC分析，分別進樣10 μL，記錄峰面積，根據兩點外標法計算樣品中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的量，結果見表2。

3 討論

3.1 提取方法考察 根據文獻［12-13］，本實驗比較了甲醇、三氯甲烷和乙醇3種溶劑對五味子木脂素提取率的影響，結果顯示其提取效果甲醇＞乙醇＞三氯甲烷，故以甲醇作為提取溶劑；同時考察了超聲提取法和加熱回流提取法，結果顯示超聲提取效率高于加熱回流提取效率；并對提取時間進行了優選，以提取20 min最佳。所以本實驗選擇以甲醇為提取溶劑，以超聲提取法提取20 min為提取方法對五味子木脂素類成分進行提取，且該方法為2010年版《中國藥典》一部五味子項下的定量測定提取方法。

表2 不同樣品中木脂素成分的測定(n=3)Tab.2 Contents of eight studied lignans in Schisandra chinensis(n=3)

3.2 色譜條件的選擇 在實驗中對多個色譜條件進行考察，包括色譜柱的選擇、甲醇-水的不同配比與梯度洗脫和乙腈-水的不同配比與梯度洗脫、檢測波長、柱溫等條件，最終確定了本實驗的色譜條件。

3.3 飲片的選擇 在研究過程中，我們收集了東北三省、湖北、內蒙古、山西等產地，但是在該色譜條件下只有東北三省的五味子飲片能夠全部測定其中7種，說明五味子具有道地性。2010年版《中國藥典》只以五味子醇甲不得少于0.4%為測定標準，從表2中可以看出所測樣品中五味子醇甲的質量分數均符合藥典規定，并且黑龍江產地的8種木脂素成分總量最高，我們又收集了黑龍江不同產地的五味子飲片，發現并不是黑龍江所有產地的都高，其中以中和鎮地區的五味子中8種木脂素成分的總量最高。但是所測樣本中8種木脂素成分在總量上沒有顯著性的差異，只是在各成分含有量構成上有所不同。

4 小結

五味子為常用補益藥，但是臨床上用的飲片質量參差不齊，木脂素含有量高低不等，療效很難保證。本實驗建立的HPLC方法，樣品中各被測組分的色譜峰基本達到基線分離，并且通過對方法學的考察，顯示該分析方法具有準確、穩定、重復性好、靈敏度高等特點。并且從測定結果可以看出，五味子中雖然主要含有五味子醇甲，但是其他成分也并不低，比如在所測樣品中五味子乙素的最低達到了0.37%，所以該研究結果表明單純以五味子醇甲的含有量來評價五味子的質量是不夠的，建議進行多指標的定量測定來控制五味子及其制劑的內在質量。本研究為中國藥典進行多指標成分控制五味子飲片質量提供科學依據，同時為進一步研究五味子及其制劑的質量控制、藥理活性以及臨床使用提供了化學成分數據支持。

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