柴苓湯對慢性環孢素A腎病大鼠腎臟細胞增殖的影響

王 霞， 孫東云， 王香婷， 王 箏， 王聰慧， 許慶友*

（1.河北醫科大學中醫學院 河北 石家莊 050091；2.河北醫科大學中西醫結合學院，河北 石家莊 050091）

環孢素A(cyclosporine A，CsA)是目前用于器官移植抗排斥反應以及自身免疫性疾病治療的一線藥物，但其腎毒性所導致的慢性損傷限制了它的長期臨床應用。近30%的環孢素A長期使用者會出現顯著的腎毒性反應［1］，其病理改變主要表現為腎間質纖維化。已有研究顯示腎間質病變與細胞過度增殖有關，故抑制細胞增殖有助于減緩腎纖維化的進展。本實驗通過復制慢性環孢素A腎病模型，探討柴苓湯是否通過調節細胞增殖這一途徑減輕環孢素A慢性腎損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 柴苓湯，顆粒型，3g/袋(每1 g制劑相當生藥量0.67 g)，購自日本TSMURA株式會社。制備工藝:柴胡7 g、黃芩3 g、半夏5 g、人參3 g、甘草2 g、生姜1 g、大棗3 g、豬苓 3 g、桂枝3 g、白術3 g、茯苓3 g、澤瀉5 g，上述藥味共煎后提取6 g，加入賦形劑至9 g。實驗時用蒸餾水配制成質量濃度為0.3 g/mL的溶液。纈沙坦由北京諾華制藥有限公司提供，批號800994。環孢素軟膠囊由華北制藥集團新藥研究發展有限責任公司提供，批號090401，用橄欖油將其配制成質量濃度為15 mg/mL的溶液，備用。免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。RT-PCR試劑盒由美國Invitrogen公司提供。Western Blot PCNA、FN抗體由美國LABVISION公司提供。流式細胞術PCNA抗體采用武漢博士德生物有限公司產品。

1.2 實驗動物及分組 40只雌性清潔級SD大鼠，8周，體質量(200±10)g，河北醫科大學動物實驗中心提供，許可證號scxk(冀)2008-1-003。隨機分為對照組、模型組(環孢素A)、柴苓湯組、纈沙坦組，每組10只。

1.3 造模及藥物治療 實驗動物適應性飼養1周后，環孢素A按30 mg/(kg·d)劑量灌服，每日1次，連續28 d，建立慢性環孢素A腎病大鼠模型；對照組每日灌胃給與等容量橄欖油。造模的同時，兩治療組分別給予柴苓湯［3 g/(kg·d)］和纈沙坦［10 mg/(kg·d)］治療，模型組和對照組每日給予等容量生理鹽水，實驗第29天，切取大鼠腎臟組織備檢。

1.4 指標檢測

1.4.1 病理組織學檢查 HE、Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟病理組織學改變，并參照Katafuchi［2］評分標準從間質炎性細胞浸潤、間質纖維化、腎小管萎縮三方面對腎小管間質損傷程度進行半定量分析，每項參數積分值為0～3分，總計0～9分。具體評定標準:無明顯病變，0分；病變＜25%，1分；病變25% ～50%，2分；病變 ＞50%，3分。

1.4.2 免疫組化檢測PCNA、FN陽性細胞表達 采用免疫組化SABC法，以光鏡下腎臟組織出現棕黃色顆粒為陽性表達。PCNA陽性細胞計數:在每個腎臟皮質切片中，觀察10個連續不同的200倍視野，以每個視野平均陽性細胞數作為比較指標。

1.4.3 Western Blot檢測PCNA、FN蛋白表達 腎組織勻漿，提取蛋白后電泳，轉膜。2%牛奶封閉，加入一抗稀釋液(1∶500)，4℃過夜，PBS-Tween洗膜3次，再加入HRP標記的二抗稀釋液(1∶5000)，孵育1 h，PBS-Tween充分洗膜后，顯影，用富士LAS-4000 LIMINESCENT圖像分析儀拍照。

1.4.4 RT-PCR檢測PCNA、FN mRNA表達 PCNA上游引物5'-CAG CAA GAC CTC GCT CCC CT-3'，下游引物5'-TCC CAT TGC CAA GCT CCC CA-3'，擴增片段長度為593 bp；FN上游引物5'-CAC CTC GAG CCC GGA TAG CA-3'，下游引物5'-TCT CTC TCC TGG CCG TCC CT-3'，擴增片段長度為433 bp；β-actin 上游引物5'-CAC GGT GTC ACC CAG ACC CG-3'，下游引物5'-AGC AGA GGC AGT GGC AGA CT-3'，擴增片段長度為273 bp。產物電泳后，紫外燈下拍照，用BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統進行分析。

1.4.5 流式細胞術檢測細胞周期 制作單細胞懸液，加入兔抗鼠PCNA抗體，室溫孵育后加入PBS洗滌，棄上清，加羊抗鼠FITC-IgG二抗，避光室溫孵育，加入PBS離心，棄上清(以除去未結合的熒光二抗)，過濾后上機檢測。采用美國BD公司FACS 420型流式細胞儀檢測細胞周期，用DNA細胞周期分析軟件，計算出DNA組方圖各時相分布的百分比，并根據公式:(PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%計算出增殖指數(PI)。

2 結果

2.1 腎臟病理 HE染色顯示:對照組未見明顯異常；模型組腎間質大量炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞壞死、脫落，腎小管萎縮；柴苓湯組及纈沙坦組病變程度明顯輕于模型組。Masson染色顯示:對照組腎間質可見少量膠原成分。模型組腎間質膠原成分大量沉積，并呈條帶狀分布；柴苓湯及纈沙坦組腎間質膠原成分較模型組明顯減少。半定量分析結果表明，模型組腎小管間質損傷各項參數積分值均明顯高于對照組(P＜0.01)，與之相比，兩治療組各項積分值則明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腎間質損傷半定量評分 (，n=10)

表1 各組大鼠腎間質損傷半定量評分 (，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 炎細胞浸潤積分 間質纖維化積分 腎小管萎縮積分 總積分對照組0.20±0.42 0.40±0.52 0.10±0.32 0.70±0.48模型組 2.60±0.52＊＊ 2.50±0.71＊＊ 2.50±0.53＊＊ 7.60±1.17＊＊柴苓湯組 1.50±0.53△△ 1.80±0.63△ 1.30±0.48△△ 4.60±1.07△△纈沙坦組 1.20±0.42△△ 1.70±0.48△△ 1.70±0.67△△ 4.60±0.97△△

2.2 免疫組化 PCNA表達情況:對照組腎小球和腎小管僅見少量PCNA陽性細胞。模型組陽性細胞較對照組明顯增多(P＜0.01)。柴苓湯及纈沙坦組PCNA陽性細胞較模型組顯著減少(P＜0.01)，但兩治療相比無明顯差異。見圖1，表2。FN表達情況:對照組FN僅在腎小管上皮細胞少量表達；模型組呈強陽性表達，染色明顯加深；經柴苓湯及纈沙坦治療后，腎小管FN表達明顯減少。見圖2。

圖1 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細胞表達 (×200)

2.3 Western Blot 對照組腎組織PCNA、FN蛋白僅少量表達，與之相比，模型組表達增強，柴苓湯組及纈沙坦組較模型組顯著減弱。見圖3。

2.4 RT-PCR 與對照組相比，模型組PCNA、FN mRNA表達明顯增強(P＜0.01)。柴苓湯及纈沙坦可下調這種高表達(P＜0.05，P＜0.01)，兩治療組基因表達無明顯差異。見圖 4，表 3。

表2 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細胞數目(，n=10)

表2 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細胞數目(，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△△P＜0.01。

組別 PCNA 陽性細胞數對照組3.90±2.38模型組 37.30±5.38＊＊柴苓湯組 21.00±3.83△△纈沙坦組 19.90±3.96△△

圖2 免疫組化檢測大鼠腎臟FN陽性細胞表達 (×200)

2.5 流式細胞術 模型組處于S期的細胞比例較對照組增多(P＜0.01)，而處于G0/G1期的細胞比例較對照組減少(P＜0.01)；柴苓湯及纈沙坦組處于S期的細胞比例較模型組明顯降低(P＜0.01)，處于G0/G1期的細胞比例較模型組增多(P＜0.01)。各組G2/M期細胞比例相對接近，組間比較無統計學差異。模型組PI較對照組明顯提高，與模型組比較，柴苓湯組及纈沙坦組PI顯著下降(P＜0.01)，但后兩組比較無顯著差異(P＞0.05))。見表4。

圖3 Western Blot檢測大鼠腎臟PCNA、FN蛋白表達

圖4 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達

表3 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達 (，n=10)

表3 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達 (，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別PCNA/18S FN/18S對照組0.71±0.06 0.89±0.03模型組 1.21±0.11＊＊ 1.21±0.02＊＊柴苓湯組 0.90±0.19△ 0.91±0.03△△纈沙坦組 0.98±0.04△ 1.02±0.04△△

3 討論

腎間質纖維化是慢性環孢素A腎病的主要病理特征，而細胞外基質(ECM)沉積是腎間質纖維化的重要病理基礎。ECM合成降解失衡以致大量蓄積與細胞增殖有關。研究表明，誘導細胞增殖，則ECM分泌增多，而抑制細胞增殖，則可使ECM蓄積減少［3］。環孢素A激活RAS后，RAS的主要活性物質血管緊張素II(AngⅡ)大量分泌，并通過與其I型受體(AT1受體)結合誘導腎小管上皮細胞、系膜細胞增殖，進而引起膠原蛋白、FN等ECM成分合成增加，降解減少，最終導致腎間質纖維化和腎小球硬化。因此，細胞增殖在腎纖維化的發生發展中發揮了重要作用［4-6］。

表4 流式細胞術檢測大鼠腎臟細胞周期的情況(，n=3)

表4 流式細胞術檢測大鼠腎臟細胞周期的情況(，n=3)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△△P＜0.01。

級別 S期/% (G0/G1)/% (G2/M)/%PI/%對照組7.67±2.25 84.57±1.91 7.80±1.49 16.37±2.04模型組 30.10±2.50＊＊ 60.67±2.14＊＊ 9.21±1.15 39.32±2.15＊＊柴苓湯組 19.93±3.16△△ 72.30±4.16△△ 7.80±1.35 27.72±4.19△△纈沙坦組 17.83±0.59△△ 74.69±1.31△△ 7.94±0.71 25.66±0.07△△

PCNA是一種與細胞增殖密切相關的核內蛋白，伴隨增殖活動而表達，因此被認為是細胞增殖的標志物，用于評價細胞的增殖狀態［7-8］。動物實驗表明，正常成年大、小鼠腎臟的各部分增殖活動并不十分活躍，PCNA在腎小管和腎小球僅有少量表達［9］。當腎臟受到損傷時，PCNA表達會顯著增加［10］。PCNA適量增加是對損傷組織的修復，但過度增加促進了臟器硬化的進展。PCNA是細胞周期依賴性蛋白，在細胞周期的各個階段合成、表達不同:G1期表達很少，S期達到高峰，G2和M期明顯下降［11］。其中G1-S是整個細胞周期的關鍵點，能夠對復雜的細胞內外信號進行整合與傳遞，保證細胞周期的正常進行［12］。FN屬于一種非膠原性糖蛋白，與細胞增殖、分化、黏附等活動關系密切。作為ECM的主要成分，其表達水平在一定程度上可以反應ECM的積聚程度，在大多數腎小球硬化及腎間質纖維化病變中都可觀察到它的過度分泌。因此，FN可作為檢測腎纖維化的主要指標之一。本研究從蛋白、基因多角度地檢測到PCNA與FN在慢性環孢素A腎病大鼠腎臟組織中呈高表達狀態。因此，抑制PCNA、FN的過度表達，對于減輕ECM增生性損傷意義重大。流式細胞術檢測結果表明，與對照組相比，模型組大鼠處于S期的細胞比例增多，增殖指數明顯提高。這提示，環孢素A具有促進細胞有絲分裂，誘導腎臟細胞增殖的作用。

本實驗同時觀察到，柴苓湯與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦療效相近，均可明顯減輕環孢素A誘導的腎組織病理損害，并下調 PCNA、FN的高表達，阻止細胞由G0/G1期進入S期，降低細胞增殖活性。柴苓湯由五苓散和小柴胡湯相合而成:五苓散通陽化氣、健脾利水，小柴胡湯和暢氣機、疏利三焦，二方相合，有疏肝健脾利水之效。研究表明該方可抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠尿蛋白排泄及炎癥細胞浸潤［13］，并可明顯減少腎組織α-SMA的表達，有效抑制腎小管上皮細胞的表型轉化［14］。本實驗結果顯示，柴苓湯可通過調節細胞周期抑制環孢素A誘導的細胞增殖，從而延緩腎臟纖維化進程。

［1］陳嘉薇.環孢素A腎毒性機制的研究進展［J］.中華器官移植雜志，2003，24(4):255-256.

［2］Katafuchi R，Kiyoshi Y，Oh Y，et al.Glomerular score as a prognosticator in IgA nephropathy:its usefulness and limitation［J］.Clin Nephrol，1998，49(1):1-8.

［3］Sam C K，Beook L A，Niedobiter G，et al.Analysis of Epstein-Barr virus infection in nasopharyngeal biopsy from a group at high risk of nasopharyngeal carcinoma［J］.Int Cancer，1993，53(6):957-962

［4］許慶友，韓 琳，谷艷麗，等.纈沙坦及紅花對單側輸尿管結扎大鼠腎臟細胞增殖的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):908-911.

［5］范煥芳，陳志強，張雪娟，等.鱉甲煎丸對人腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質表達的影響［J］.中成藥，2007，29(2):183-186.

［6］韓 琳.細胞增殖在腎間質纖維化中的意義［D］.石家莊:河北醫科大學，2004.

［7］Barratt J，Feehally J.Treatment of IgA nephropathy［J］.Kidney Int，2006，69(11):1934-1938.

［8］Lee D W，Kwak I S，Lee S B，et al.Post-treatment effects of erythropoietin and nordihydroguaiaretic acid on recovery from cisplatin induced acute renal failure in the rat［J］.J Korean Med Sci，2009，24 Suppl:S170-S175.

［9］王杰玉，楊 杰，李勇莉，等.ATP7B和PCNA在大鼠、小鼠空腸及腎的表達［J］.動物學雜志，2010，45(4):156-163.

［10］張慧瓊，易著文，何小解.增殖細胞核抗原、細胞凋亡在腎病綜合征激素耐藥中的作用［J］.實用兒科臨床雜志，2006，21(17):1139-1142.

［11］黃杰雄.增殖細胞核抗原的研究進展［J］.國外醫學生理、病理科學與臨床分冊，1994，14(1):9-11.

［12］韓 琳，秦建國，陳志強.鱉甲煎丸對腎間質纖維化大鼠細胞增殖的影響［J］.北京中醫藥大學學報，2009，32(7):457-461.

［13］李 平，趙世萍，李亞俊，等.柴苓湯及其組方對大鼠系膜增生性腎炎的治療作用［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2006，7(5):2587-262.

［14］王香婷，魏 民，王 霞，等.柴苓湯對環孢素A腎病大鼠腎小管上皮細胞表型轉化的抑制作用［J］.中國中西醫結合雜志，2011，31(1):94-98.