天山雪蓮傳遞體包封率測定方法的研究

馬曉莉， 邢建國， 王新春，3， 袁 勇，3， 連文元， 謝 敏

（1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；3.石河子大學醫學院一附院 新疆 石河子 832008）

天山雪蓮是菊科Asteraceae鳳毛菊屬Saussurea多年生草本植物，是維吾爾醫常用的民族藥，具有消炎鎮痛、消腫、活血化瘀等作用。綠原酸及蘆丁是天山雪蓮提取物中主要活性成分［1-3］。

傳遞體(transfersomes)亦稱柔性納米脂質體，是在脂質體基礎上，通過磷脂成分中加入表面活性物質如膽酸鈉等制備而成的一種自聚集泡囊，具有高度變形性、高度親水性及高效滲透性等特點，是一種透皮效果更優于脂質體的新型藥物經皮滲透載體［4］。

因此，進行天山雪蓮傳遞體的研究是天山雪蓮新型透皮給藥體系探索研究的重要內容。包封率是傳遞體質量評價的重要指標，本實驗以綠原酸和蘆丁為指標性成分，建立了兩個指標同時測定天山雪蓮傳遞體包封率的方法，該法操作簡單，可行，準確性較好，為天山雪蓮傳遞體制備工藝研究提供了科學依據。

1 儀器與試劑

十萬分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；FA25高剪切分散乳化勻質機(上海弗魯克流體機械制造有限公司)；HJ-7六聯恒溫攪拌器(金壇市華峰儀器有限公司)；透析袋(截留分子量14000，上海藍季科技發展有限公司)；日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀；SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)。蘆丁、綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100080- 200707；110753-200413)；天山雪蓮提取物(新疆自治區藥物研究所自制，含綠原酸和蘆丁分別為:4.415%，11.532%，批號:20090516)；注射用大豆卵磷脂(上海東尚實業公司中國總代理，批號:1031778)；膽酸鈉(上海藍季科技發展有限公司，批號:080628)；磷酸二氫鉀(天津市光復科技發展有限公司)；氫氧化鈉；無水乙醇、甲醇等試劑均為分析純。

2 實驗法和結果

2.1 天山雪蓮傳遞體的制備 采用注入-高剪切分散法制備天山雪蓮傳遞體。將天山雪蓮提取物、大豆卵磷脂及膽酸鈉以質量比1∶18∶3溶于適量無水乙醇中；另取規定體積的水合介質磷酸鹽緩沖液(pH7.4)置燒杯中，開啟恒溫攪拌儀(400 r/min)，在不斷攪拌下勻速注入無水乙醇溶液，后進行高剪切處理(10000 r/min)1 min，即得天山雪蓮傳遞體混懸液，冰箱4℃保存。

2.2 蘆丁、綠原酸分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脫:0～12 min:12%A，13～16 min:15%A，16～40 min:15%A；檢測波長353 nm；體積流量1 mL/min；柱溫35℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。結果，在此色譜條件下，傳遞體中的輔料對藥物測定無干擾，綠原酸和蘆丁的保留時間分別約為8.1 min和29.5 min。

圖1 天山雪蓮傳遞體HPLC圖

2.2.2 標準曲線的制備 分別精密稱取綠原酸、蘆丁對照品適量，加甲醇溶解，定容，得480 μg/mL綠原酸和650 μg/mL蘆丁對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液各2.5 mL至25 mL棕色量瓶，甲醇定容，配成綠原酸、蘆丁的質量濃度分別為48.0、65.0 μg/mL混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 和10.0 mL加甲醇稀釋至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法進樣測定。以質量濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸回歸方程:A=12383 C－20310，R=0.9998；蘆丁的回歸方程為:A=18642 C－8457.6，R=0.9997。結果表明，綠原酸質量濃度在1.2～48 μg/mL范圍內，蘆丁質量濃度在1.625～65 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 天山雪蓮傳遞體包封率測定方法

2.3.1 反透析平衡時間的確定 按上述方法制備天山雪蓮傳遞體，取25 mL置于透析袋外，水合介質1 mL置于透析袋內，扎緊透析袋，開啟恒溫振蕩儀，分別于 0、1、2、4、6、8、10、12和16 h取透析袋內液，采用上述HPLC法測定游離藥物質量濃度。結果見圖2，由圖可見，6 h綠原酸質量濃度達到最大值，蘆丁8 h質量濃度達到最大值。綜合考慮，天山雪蓮傳遞體的透析平衡時間為10 h。

圖2 綠原酸與蘆丁反透析平衡

2.3.2 反透析游離藥物回收率 分別精密吸取系列體積的綠原酸和蘆丁對照品貯備液，用水合介質配制系列不同質量濃度的綠原酸和蘆丁混合標準溶液，移取該標準混合液25 mL置于透析袋外，水合介質1 mL于透析袋內，開啟恒溫振蕩儀，透析平衡后取透析袋內液，HPLC法測定藥物質量濃度C1，透析前標準混合溶液中綠原酸和蘆丁的質量濃度C2。結果，見表1。反透析游離藥物回收率計算公式為:回收率=(C1×26)/C2×25)×100%。

2.3.3 反透析加樣回收率 精密吸取綠原酸和蘆丁對照品貯備液，分別與空白傳遞體混合配制系列標準混合液，移取該標準混合液25 mL置于透析袋外，水合介質1 mL于透析袋內，開啟恒溫振蕩儀，透析平衡后取透析袋內液，HPLC法測定藥物質量濃度C3，透析前標準混合溶液中綠原酸和蘆丁的質量濃度C4。結果，見表2。反透析法的加樣回收率計算公式為:加樣回收率=(C3×26)/(C4×25)×100%。

表1 綠原酸及蘆丁反透析法回收率(n=3)

表2 綠原酸及蘆丁加樣回收率(n=3)

2.3.4 反透析法測定傳遞體包封率 移取3批天山雪蓮傳遞體25 mL于透析袋外，磷酸鹽緩沖溶液1 mL于透析袋內，開啟恒溫振蕩儀振搖，透析平衡后，取各透析袋內液，HPLC法測定游離藥物質量濃度Cf。藥物的總質量濃度Ct以傳遞體中綠原酸和蘆丁的理論含有量表示。結果見表3。包封率的計算公式為:包封率 =(Ct×25-Cf×26)/(Ct×25)×100%。

表3 反透析法測定天山雪蓮傳遞體包封率(n=3)

3 討論

藥物敷貼療法是中醫外治法之一種，與現代透皮給藥相似。藥物敷貼療法的難點之一是如何使更多的藥物透過皮膚，進入血液循環，從而提高藥物的功效。中藥傳遞體由于小的粒徑和大的選擇吸附能力，可能有更強的穿透能力，使更多的重要成分可以穿透皮膚屏障，進入血液循環。因此，依據課題組已有天山雪蓮透皮制劑研究基礎［5-6］，開展維藥天山雪蓮傳遞體的研究具有較強的可行性和探索性。

指標性成分的選擇是中藥制劑制備工藝研究的關鍵。目前，以一個藥效成分為指標建立中藥納米制劑藥物包封率測定方法的研究報道較多，但以中藥提取物中多個藥效成分為指標進行中藥納米制劑藥物包封率測定方法的研究卻鮮有報道。因此，本實驗以藥效成分綠原酸和蘆丁為指標，建立了天山雪蓮傳遞體包封率的測定方法，為科學優化傳遞體制備工藝奠定了基礎。

天山雪蓮傳遞體反透析平衡時間結果表明，綠原酸在6 h達到透析平衡，蘆丁在8 h達到透析平衡，因此，為保證樣品測定的準確性和試驗效率，透析平衡時間確定為10 h。

［1］李君山，蔡少青.雪蓮花類藥材的化學和藥理研究進展［J］.中國藥學雜志，1998，33(8):449-452

［2］薛秀峰，陳華山，熊志立，等.RP-HPLC法同時測定雪蓮注射液中3種成分的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2005，22(5):363-366.

［3］Elsayed M M，Abdallah O Y，Naggar V F，et al.Deformable liposomes and ethosomes:Mechanism of enhanced skin delivery［J］.Int J Pharm，2006，322(1-2):60-66.

［4］謝悅良，張比奎.柔性納米脂質體的研究進展［J］.中國藥房，2008，19(25)，1983-1985

［5］黃賢惠，邢建國，王新春，等.正交設計法優選天山雪蓮凝膠劑基質處方［J］. 中國中藥雜志，2010，35(14):1803-1805.

［6］邢建國，翟科峰，王新春，等.透皮促進劑對天山雪蓮巴布劑中三種有效成分經皮滲透的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34(13):1661-1664.