微乳TLC應用于療筋涂膜劑中分離鑒定的對比研究

李得堂， 張麗娟， 唐洪梅*， 蔡慶群， 丘振文， 廖小紅

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學附屬中山醫院，廣東 中山 528400；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405）

療筋涂膜劑由我院院內制劑改良研制開發，由大黃、兩面針、黃芩、冰片、薄荷腦等中藥組成，具有活血祛瘀、消腫止痛的功效。主要用于外傷性疾病和風濕性疾病［1-3］。常用有機溶劑為展開劑的薄層色譜法在療筋涂膜劑黃芩的鑒別中出現斑點明顯的拖尾和擴散，經過多次變換展開劑及比例、控制展開溫濕度等均不能改善，引用微乳液為展開劑的薄層色譜，通過對比研究發現，可以明顯改善常用展開劑鑒別黃芩時斑點拖尾嚴重、擴散的現象，分離效果及檢測靈敏度顯著提高，且斑點圓而集中，供試品清晰觀察的斑點數由傳統薄層色譜3個增加到9個，Rf值高的成分亦無擴散現象。微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按適當比例自發生成的無色透明、各向同性、低黏度的熱力學穩定體系，與膠束體系皆屬締和膠體，但在基本特性上存在著明顯的差別。微乳體系與膠束體系相比，具有更大的增溶量(增溶量:膠束體系5% ～20%，微乳體系60% ～70%)和超低界面張力(界面張力:油水界面72，膠束體系20，微乳體系10－2～10－4)［4-5］。微乳體系的以上優勢有利于提高色譜的效率。參考文獻［6-7］以含水量不同，具有油包水(W/O)型、雙連續型(W/O～O/W)及水包油(O/W)型的6種SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液為展開劑，應用于療筋涂膜劑中黃芩分離鑒定的研究發現，75%的微乳液為展開劑可以改善常用展開劑鑒別黃芩時斑點拖尾嚴重、擴散的現象，通過進一步優化文獻微乳液的配比，分離效果及檢測靈敏度更顯著提高，此方法應用于蘇木，兩面針等成分也得到較理想的效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CAMAG薄層色譜系統(UV-LAMPEN，TLC Plate HeaterⅢ，Holder for Digital Camera for Reprostar 3)，點樣用定量毛細管(日本)；層析玻璃缸；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；恒溫干燥箱(北京市朝陽區來廣營醫療器械廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗設備有限公司)；電子分析天平(SARTORIUS AG GOTTINGEN Germany BP211D)。

1.2 試藥 療筋涂膜劑(制劑室自制，091223，091225，091227)；硅膠G(青島海洋化工廠)；層析用聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四青生化塑料廠)；黃芩苷對照品、黃芩、蘇木、兩面針對照藥材(中國藥品生物制品檢定所)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(天津市大茂化學試劑廠)；正庚烷(天津市大茂化學試劑廠)；正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 微乳展開劑的配制2.1.1文獻微乳展開劑的配制［6-8］在保證SDS-正丁醇-正庚烷為0.27∶0.63∶0.10(質量比)的條件下，改變水量，配制一系列微乳展開劑。按上述質量比取SDS、正丁醇、正庚烷，加適量水攪拌溶解，超聲5 min，然后加水至足量，混勻，放置24 h即可。6種微乳液的成分配比及結構見表1。

表1 微乳展開劑成分配比及結構(總量100 g)

2.1.2 經過改良優化后微乳展開劑的配制［9］優化后SDS-正丁醇-正庚烷質量比為0.39∶0.52∶0.09，配制方法同

2.1.1 項下。6種微乳液的成分配比及結構見表2。選取文獻配制一系列微乳展開劑，應用于療筋涂膜劑中黃芩分離鑒定研究發現，W/O型微乳液(15% ～30%)為展開劑，色譜中斑點不規則，分離效果極差，展開速度較慢，兩個溶劑前沿均不平整，基本不能分離，以油水雙連續型微乳液(45% ～60%)為展開劑，分離度等有所改善，但也常常不理想，也達不到預期效果，以O/W型微乳液(70% ～80%)為展開劑，供試品中較多的組分達到分離，斑點規則集中，可以改善常用展開劑分離鑒定黃芩時斑點拖尾嚴重、擴散的現象，兩個溶劑前沿也不平整，展開組分軌跡常跑偏，通過進一步優化文獻微乳液的配比對比研究發現，以O/W型微乳液(70% ～75%)為展開劑，SDS-正丁醇-正庚烷質量比為0.39∶0.52∶0.09，分離效果及檢測靈敏度更顯著提高，兩個溶劑前沿平整，組分軌跡平直。含水量75%微乳液為展開劑較70%含水量微乳液分離效果好，而且多分離出2個斑點，最終選擇以改良后75%含水量O/W型微乳液為展開劑用于黃芩、蘇木及兩面針等成分，分離效果及檢測靈敏度較高，得到較滿意的效果。

表2 微乳展開劑成分配比及結構(總量100 g)

2.2 常用展開劑應用于黃芩的鑒別 取本品4 g，加乙醚30 mL，超聲10 min，濾過，藥渣揮干乙醚，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用鹽酸調節pH為1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。再取缺黃芩的涂膜劑，同供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述供試品溶液、陰性樣品溶液各4 μL以及對照品溶液1 μL，分別點于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板和聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗綠色斑點，經過反復試驗，改變供試品制備方法，變換展開劑及比例、控制展開溫濕度等方法，黃芩苷斑點均拖尾和擴散。薄層色譜結果見圖1。

圖1 黃芩傳統薄層色譜圖

2.3 微乳液為展開劑應用于黃芩的分離鑒定 取黃芩對照藥材1 g，照2.2項下制備黃芩的對照藥材溶液，照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，取2.2項下供試品溶液、陰性樣品溶液、對照品及對照藥材溶液各1 μL，分別點于聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視；黃芩苷為深藍色斑點，斑點圓而不拖尾不擴散，供試品清晰觀察的斑點數為6個，Rf值高的成分亦無擴散現象，陰性對照無干擾。噴2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，均顯相同顏色的斑點，斑點圓且集中，此時黃芩苷為深綠色斑點，供試品清晰觀察的斑點數為9個，Rf值高的成分亦無擴散現象，3批供試品與黃芩對照藥材溶液相同顏色位置有5個清晰的斑點。陰性樣品無干擾，本方法專屬性好，可以明顯改善常用展開劑鑒別黃芩時斑點拖尾嚴重、擴散的現象，分離效果及檢測靈敏度顯著提高，且斑點圓而集中，清晰觀察的斑點數較多，Rf值高的成分亦無擴散現象，說明微乳薄層色譜法可以簡便、準確、高效地分離和鑒定療筋涂膜劑中黃芩成分。薄層色譜結果見圖2(a.365 nm熒光下，b.日光下)

圖2 黃芩微乳薄層色譜圖

2.4 微乳液為展開劑應用于蘇木、兩面針的同時分離鑒定 以上述微乳液為展開劑，將該法應用于療筋涂膜劑中蘇木、兩面針同時分離鑒定。取供試品2 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取蘇木、兩面針對照藥材各0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取缺蘇木、兩面針的涂膜劑，同供試品溶液制備法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與蘇木、兩面針對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性樣品無干擾，本法專屬性好。供試品與蘇木及兩面針在色譜中清晰可見各2個熒光斑點，斑點圓，無擴散，分離效果及檢測靈敏度較好。結果見圖3。

3 討論

本實驗鑒于常用展開劑薄層色譜法應用于療筋涂膜劑中黃芩等鑒別的斑點拖尾，擴散等現象，采用75%含水量O/W型微乳液為展開劑的微乳薄層色譜法分離鑒定，與傳統薄層色譜法對比研究，可以明顯改善常用展開劑鑒別黃芩時斑點拖尾嚴重、擴散的現象，分離效果及檢測靈敏度顯著提高，且斑點圓而集中，供試品清晰觀察的斑點數增加到9個，Rf值高的成分亦無擴散現象。

圖3 蘇木、兩面針微乳薄層色譜圖

通過對文獻微乳基本配比進行改良，選取改良后微乳基本配比的不同含水量微乳液與文獻中配比為展開劑對比研究發現，W/O型微乳液(15% ～30%)為展開劑，色譜中斑點不規則，展開速度極慢，分離效果較差，以油水雙連續型微乳液(45% ～60%)為展開劑，分離度等有所改善，但常不理想；以O/W型微乳液(70% ～75%)為展開劑，供試品中較多的組分達到完全分離，斑點規則集中，含水量75%微乳液為展開劑較70%含水量微乳液分離效果好，而且多分離出2個斑點，最終選擇以改良后75%含水量O/W型微乳液為展開劑，微乳液 SDS-正丁醇-正庚烷質量比為 0.39 ∶0.52∶0.09，分離效果及檢測靈敏度較高，得到較滿意的效果。

微乳薄層色譜法展開劑使用不同含水量的微乳液，主要成分為水，且用量少，揮發性較小，徹底替代甲苯、苯等毒性大、致癌、污染大的有機溶劑作為展開劑；成本小、降低藥材及成品檢驗的高成本；環保，對實驗人員身體損害小；微乳液具有比膠束體系更大的增溶量和超低界面張力，更大提高色譜效率。微乳展開系統的增溶、降低界面張力、靜電、疏水及立體效應，使其具有獨特的選擇性，可同時分離親水物質和疏水物質，對帶電成分和非帶電成分亦有較好的分離選擇，適用于分離差別很小的物質，色譜效率高。組分斑點不擴散，不受溫度(室溫)、濕度的顯著影響、與常用展開劑相比，微乳液使斑點的熒光強度得到肯定的增強，因而檢測的靈敏度得以顯著提高，供試品制備可以只采用甲醇提取，節省有機溶劑，省去了常用展開劑薄層色譜法中的多極性溶劑提取分離、多次萃取等繁瑣的“萃取、清洗”等步驟，極大地節省了實驗的時間和提高了實驗的重復性［10-11］。

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