濃縮石榴汁中熊果苷的超高效液相－串聯(lián)質譜檢測方法研究

何 強，孔祥虹，李建華，樂愛山，吳雙民

(陜西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，陜西西安710068)

濃縮石榴汁中熊果苷的超高效液相－串聯(lián)質譜檢測方法研究

何 強，孔祥虹，李建華，樂愛山，吳雙民

(陜西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，陜西西安710068)

建立了濃縮石榴汁樣品中熊果苷含量測定的固相萃?。咝б合啵?lián)質譜測定方法。樣品用水稀釋，HLB和氨基固相萃取柱凈化，采用BEH Amide色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)分離，以乙腈和水梯度洗脫，多反應監(jiān)測模式測定，定量離子對為m/z 271.2＞108.0，定性離子對為m/z 271.2＞160.9，外標法定量。熊果苷的檢測限為0.006mg/kg，在0.004～0.2mg/L濃度范圍內，熊果苷的線性相關系數(shù)為0.9994，熊果苷的加標回收率均在80.6%～108.1%范圍內，相對標準偏差均低于8.3%。該方法樣品凈化效果良好，檢測簡便、快速、準確，能夠滿足濃縮石榴汁中熊果苷含量測定和定性確證的要求。

濃縮石榴汁，熊果苷，固相萃取，超高效液相－串聯(lián)質譜

果汁摻假是果汁生產行業(yè)的一種不法行為，利用價格較低的水果或果汁摻入到價格高的水果原料果或果汁中是一種已被曝光的違法行為，在鑒偽技術方面已有較多的研究［1］，但對濃縮石榴汁的摻偽鑒別研究較少，由于石榴汁的價格遠高于梨汁，如何鑒別石榴汁中摻入梨汁對于辨別石榴汁的純正性，維護消費者的合法權益具有重要意義。熊果苷是梨果實中的一種特征成分［2］，而石榴中尚未見有關于熊果苷的文獻報道，本實驗室的前期研究中也未從石榴中檢出熊果苷成分，所以利用檢測熊果苷這一特征成分來鑒別石榴汁中是否摻入梨汁是一種可行的方法。目前濃縮石榴汁中熊果苷的檢測方法研究較少，相關方法主要是化妝品和中草藥中熊果苷的檢測，主流方法是高效液相色譜法［3－7］及液相色譜質譜法［8－10］，另外薄層色譜法［11］、毛細管電泳法［12］、氣相色譜－質譜法［13］、電化學法［14－15］等也有相關報道，文獻報道的高效液相色譜法及液相色譜－質譜法均采用反向色譜柱分離熊果苷，而由于熊果苷極性較大，流動相需要高比例的水相，抑制熊果苷質譜檢測時的電離，而且分離效果不佳。本研究利用HLB柱和氨基柱組合固相萃取的方法提高樣品凈化效果，選擇新型BEH Amide色譜柱進行樣品分離以提高分離效果及靈敏度，選擇超高效液相－串聯(lián)質譜法檢測以實現(xiàn)定量分析與定性確證同時進行。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃縮石榴汁 均為送檢樣品;熊果苷標準品美國Sigma公司;乙腈、甲醇(HPLC級) 德國MERCK公司;無水硫酸鈉 分析純，天津市津北精細化工有限公司(使用前于650℃灼燒4h);水為超純水 美國Millipore公司，Milli－Q超純水凈化系統(tǒng)制備。

Oasis HLB固相萃取柱(200mg，6cc)、Sep－Pak Vac NH2固相萃取柱(200mg，6cc) 美國Waters公司;AcquityTM超高效液相色譜儀 配Quattro Premier XE串聯(lián)質譜儀、電噴霧電離(ESI)接口，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 將熊果苷標準品用甲醇溶解配制成1.0mg/mL的標準儲備液，置于4℃冰箱保存，標準使用溶液用乙腈逐級稀釋。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取5g(精確至0.01g)試樣置于50mL離心管中，加入約20mL水，振搖混勻，定容至25.0mL。將HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇、10mL水活化，準確移取5mL試樣溶液上樣，控制流速2～3mL/min，待樣品溶液流完后，減壓抽干20min，在NH2固相萃取柱上端裝填約2cm高的無水硫酸鈉，并用5mL乙腈活化后串接在抽干的HLB柱下方，用12mL乙腈淋洗，控制流速約2mL/min，棄去流出液，去掉HLB固相萃取柱，將NH2柱再用15mL乙腈－甲醇(1∶1，v/v)洗脫，洗脫液于40℃水浴中減壓濃縮至干，用5.00mL乙腈溶解定容，過0.2μm有機微孔濾膜，供液相色譜－串聯(lián)質譜測定和確證。

1.2.3 測定條件 ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm);柱溫35℃;流動相采用乙腈－水梯度洗脫，首先在1.0min時間內，乙腈保持95%，然后在1.0～5.0min乙腈由95%線性遞減至50%，水則由5%線性遞增至50%，最后在0.2min內恢復到流動相的初始比例，保持2min;流速0.2mL/min;進樣量2μL。

離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負離子掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)，定量離子對為m/z 271.2＞108.0，定性離子對為m/z 271.2＞160.9;毛細管電壓3kV;萃取電壓3V;錐孔電壓30V;定量離子和定性離子的碰撞能量分別為25、10eV;離子源溫度110℃;脫溶劑溫度400℃;脫溶劑氣流量:500L/h;錐孔氣流量50L/h;碰撞室氬氣流量0.2mL/min(真空度約3×10－5MPa);四級桿分辨率為15.0。

1.2.4 方法適用性實驗 對線性關系、檢出限、儀器精密度、方法重現(xiàn)性、加標回收率等進行了實驗考察。

1.2.4.1 線性關系 配制濃度為0.004、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L熊果苷系列標準溶液，按1.2.3規(guī)定的色譜－質譜條件進樣檢測，并以標準濃度(X， mg/L)為橫坐標，定量離子離子流圖的峰面積(Y)為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，考察方法的線性關系。

1.2.4.2 檢出限 取含有熊果苷的濃縮石榴汁樣品溶液稀釋進樣，采用標準曲線法定量，按3倍信噪比計算檢出限，按10倍信噪比計算最低定量限。

1.2.4.3 儀器精密度、方法重現(xiàn)性 取濃度為0.02mg/L的熊果苷標準溶液，連續(xù)進樣6次，記錄定量離子對離子流圖的峰面積，計算峰面積相對標準偏差，考察儀器的精密度。取含有熊果苷的濃縮石榴汁樣品按照1.2.2的方法平行處理6份，進樣檢測，計算測定結果相對標準偏差，考察方法的重現(xiàn)性。

1.2.4.4 加標回收率實驗 取不含熊果苷的濃縮石榴汁樣品進行，每個樣品添加0.1、0.2、0.4mg/kg三個水平的熊果苷，每個添加水平重復10次，計算回收率及回收率相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 凈化條件的考察

由于熊果苷的極性較大，而且不具有離子化的特性，復雜樣品中微量熊果苷的提取凈化一直是個難題，相關研究也較少。本實驗將濃縮石榴汁用水稀釋后過固相萃取柱，熊果苷在C18、NH2、PSA、MCX、MAX等固相萃取柱上基本都沒有保留，在活性炭固相萃取柱上也僅有較少的保留，而HLB柱(200mg，6cc)對熊果苷有較好的吸附作用，但對濃縮石榴汁中的主成分糖類物質基本沒有吸附，所以選擇HLB柱可以有效去除糖類等物質。實驗中發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的HLB柱對果汁中熊果苷的吸附作用差別較大，60mg、3cc的HLB柱對果汁中的熊果苷的回收率僅約30%左右，可能是由于60mg的HLB柱吸附量較小，容易超載而造成回收率差。

接著考察了HLB柱、HLB柱串聯(lián)NH2柱、HLB柱串聯(lián)PSA柱等幾種情況，僅用HLB柱凈化不完全，在質譜檢測時容易產生基質效應，HLB柱串聯(lián)PSA柱對一些低極性雜質的去除效果不理想，而HLB柱串聯(lián)NH2柱可以通過改變淋洗及洗脫條件，有效去掉果汁中的干擾雜質，所以最終選擇HLB柱串聯(lián)NH2柱進行樣品凈化。

利用凈化后的空白濃縮石榴汁樣品溶液配制熊果苷的基質標準溶液，并與相同濃度的熊果苷標準溶液相比較，分別重復進樣3次、6次測定質譜響應值的相對標準偏差為4.8%，可判斷經樣品凈化及色譜分離后，濃縮石榴汁樣品對熊果苷基本不存在質譜基質效應。

2.2 測定條件的優(yōu)化

首先采用毛細管進樣模式對熊果苷標準溶液的質譜檢測條件進行了考察，由于熊果苷化學結構中含有多個羥基，適合采用負離子模式進行檢測，首先比較了電噴霧負離子模式(ESI－)和大氣壓化學電離負離子模式(APCI－)，發(fā)現(xiàn)熊果苷在ESI－模式下的響應值較高，所以選用ESI－模式進行測定，然后在毛細管連續(xù)進樣模式下對熊果苷的質譜參數(shù)進行優(yōu)化，以獲取最高的靈敏度，最終確定了1.2.3中的質譜條件。

接著對色譜條件進行了考察，比較了BEH C18、HSS T3、BEH Amide、BEH HILIC等色譜柱。其中BEH C18、HSS T3屬于反相色譜柱，熊果苷極性大，分離時需要高比例的水相，不利于熊果苷的質譜電離，而且色譜出峰早，分離不夠理想;而BEH HILIC色譜柱對熊果苷基本沒有吸附;BEH Amide色譜柱對熊果苷的保留效果良好，而且流動相采用高比例的有機相，便于質譜電離及提高響應值的穩(wěn)定性，流動相中乙腈為90%時熊果苷的質譜響應值比流動相中水為90%時提高20倍以上。

流動相選擇時，考察了乙腈－水、乙腈－甲醇系統(tǒng)，由于乙腈－水系統(tǒng)的色譜峰形及保留特性優(yōu)于乙腈－甲醇系統(tǒng)，所以選擇乙腈－水系統(tǒng)作為流動相，而采用1.2.3的梯度洗脫條件，可以提高色譜分離效果，有效地降低樣品基質效應，熊果苷選擇離子對離子流圖如圖1所示，熊果苷定性離子對與定量離子對的豐度比約為82%。

圖1 標準溶液定量離子對(a)及定性離子對(b)的離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of quantitative ion pair(a) and qualitative ion pair(b)

2.3 線性關系與檢出限

熊果苷的標準曲線回歸方程為Y=401.382X+ 5.08717，線性相關系數(shù)r為0.9994，線性關系良好。

濃縮石榴汁中熊果苷的最低檢出濃度為0.0012mg/L，最低定量濃度為0.004mg/L，根據樣品前處理方法換算，本方法的最低檢出限為0.006mg/kg，最低定量限為0.02mg/kg。

2.4 儀器精密度與方法重現(xiàn)性

濃度為0.02mg/L的熊果苷標準溶液6次測定峰面積的相對標準偏差為2.2%，儀器精密度良好。

平行處理的6份濃縮石榴汁樣品中熊果苷的測得量分別為1.85、1.76、1.92、1.69、1.81、1.75mg/kg，測定結果的相對標準偏差為4.5%，重現(xiàn)性良好。

2.5 加標回收率實驗

加標回收率及精密度數(shù)據如表1所示，回收率均在80.6%～108.1%范圍內，相對標準偏差在6.9%～8.3%范圍內，滿足檢測要求。

表1 回收率及精密度測定結果(n=10)Table 1 Results of recoveries and precisions(n=10)

2.6 樣品測定

利用本方法檢測了7批濃縮石榴汁樣品，僅1批濃縮石榴汁中未檢出熊果苷，其余樣品中檢出熊果苷含量在0.05～3.4mg/kg范圍內，說明熊果苷在濃縮石榴汁中微量存在具有一定的普遍性，這些微量熊果苷可能來源于原料果中摻入的少量梨或果汁生產過程中的污染，由于本方法的靈敏度比已有方法提高10倍以上，也不能排除濃縮石榴汁中本身含有極微量的熊果苷，但在已有研究中未被檢測出來，需要進一步的研究確認。

3 結論

本方法采用HLB固相萃取柱結合氨基固相萃取柱提取凈化濃縮石榴汁中的熊果苷，并采用新型BEH Amide色譜柱分離熊果苷，取得了良好的效果。該方法樣品凈化過程采用兩種不同凈化機理的固相萃取柱相結合，凈化效果好，能夠有效地去除干擾組分，利用BEH Amide色譜柱的分離效果良好，而且可以保證熊果苷在高比例有機相條件下電離，與已有的檢測方法［9］比較，在進樣量減少2.5倍的情況下，仍可以提高熊果苷的檢測靈敏度10倍以上。

［1］蘇光明，胡小松，廖小軍，等.果汁鑒偽技術研究新進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(6):151－156.

［2］TanrI?ven D，Eksi A.Phenolic compounds in pear juice from different cultivars［J］.Food Chemistry，2005，93(1):89－93.

［3］林彩，劉松青，賀紅軍，等.復方維生素E霜中熊果苷和維生素E的含量測定［J］.中國藥業(yè)，2010，19(9):29－30.

［4］程鵬，陳梅蘭，朱巖.高效液相色譜法測定化妝品中α－、β－熊果苷及煙酰胺［J］.色譜，2010，28(1):89－92.

［5］孫素珍.超高壓液相色譜法測定雞矢藤熊果苷含量［J］.江蘇農業(yè)科學，2010(3):387－388.

［6］Nisit K，Aueporn C，Umaporn P，et al.High－performance liquid chromatographic method for separation and quantitative analysis of arbutin in plant tissue cultures［J］.Chiang Mai University Journal of Natural Sciences，2007，6(1):65－74.

［7］Thongchai W，Liawruangrath B，Liawruanggrath S.High performance liquid chromatographic determination of arbutin in skin－whitening creams and medicinal plant extracts［J］.Journal of Cosmetic Science，2007，58(1):35－44.

［8］Carmen P，Laurian V，Mircea T.Determination of arbutin in the leaves of Bergenia crassifolia(L.)fritsch acclimated in Romania［J］.Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj－Napoca，2009，37(1):129－132.

［9］孔祥虹，何強，樂愛山，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法測定濃縮蘋果汁中的熊果苷［J］.色譜，2010，28(6):632－634.［10］趙潔，何強，孔祥虹，等.固相萃?。咝б合嗌V－電噴霧串聯(lián)質譜法檢測梨樹葉中熊果苷［J］.分析實驗室，2011，30(2):58－61.

［11］唐新雯，劉廷江.薄層色譜法測定毛大丁草中熊果苷含量［J］.中國藥業(yè)，2009，18(3):29.

［12］Lin Y H，Yang Y H，Wu S M.Experimental design and capillary electrophoresis for simultaneous analysis of arbutin，kojic acid and hydroquinone in cosmetics［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44(1):279－282.

［13］ChisvertA，SisternesJ，Balaguerá，etal.A gas chromatography－mass spectrometric method to determine skinwhitening agents in cosmetic products［J］.Talanta，2010，81 (1－2):530－536.

［14］劉心同，汪慶祥，高宏偉.伏安法測定化妝品中熊果苷［J］.理化檢驗－化學分冊，2008，44(3):209－211.

［15］Miki K，Hayashi T，Kinoshita H.Determination of arbutin using glucosidase－immobilized electrode［J］.Nippon kagakkai koen yokoshu，2006，86(1):644－648.

Study on detection method of arbutin in pomegranate juice concentrates by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

HE Qiang，KONG Xiang－h(huán)ong，LI Jian－h(huán)ua，YUE Ai－shan，WU Shuang－min
(Technical Center，Shaanxi Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Xi’an 710068，China)

A method was developed for the determination of arbutin in pomegranate juice concentrate by solid phase extraction(SPE)and ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry(UPLC－MS/ MS).Samples were diluted by water and then cleanup with HLB and aminopropyl SPE columns.UPLC was performed on a BEH Amide column(100mm×2.1mm，1.7μm)using a gradient acetonitrile－water system as mobile phase，and MS/MS was performed with multiple reation monitoring(MRM)mode using m/z 271.2＞108.0 as quantitative ion pair and m/z 271.2＞160.9 as qualitative ion pair.Quantitation was carried out using an external standard method.The detection limit of arbutin was 0.006mg/kg and the calibration curves were linear at the range of 0.004～0.2mg/L with linear correlation coefficient as 0.9994.The recoveries ranged from 80.6%to 108.1%with relative standard deviations less than 8.3%.The results of sample cleanup were well，and the determination method was simple，fast and sufficient.It was suitable for quantitative and qualitative analysis of arbutin in pomegranate juice concentrate.

pomegranate juice concentrate;arbutin;solid phase extraction;ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

TS255.7

A

1002－0306(2012)10－0062－04

2011－08－16

何強(1980－)，男，碩士，高級工程師，主要從事食品檢測技術方面的研究。

陜西省農業(yè)攻關項目(2010K01－19－4);國家質檢總局科研項目(2009IK285);陜西出入境檢驗檢疫局科研項目(2010IK001)。