正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化棗核黃酮的超聲提取工藝研究

張吉祥，歐來良

(1.廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000; 2.南開大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子生物研究所，天津300071)

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化棗核黃酮的超聲提取工藝研究

張吉祥1，歐來良2

(1.廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000; 2.南開大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子生物研究所，天津300071)

采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選棗核中總黃酮的最佳超聲提取工藝。以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，以棗核中黃酮含量作為考查指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響，再利用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，對(duì)棗核黃酮提取影響的大小次序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲波功率，最佳提取工藝為:提取溫度55℃，料液比為1∶50，提取時(shí)間為40min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，超聲波功率為400W，在該條件下棗核黃酮粗品的提取率為12.45%，粗品中黃酮含量為6.83mg·g－1，能顯著提高棗核黃酮的提取效率。

正交實(shí)驗(yàn)法，超聲，提取，棗核，總黃酮

紅棗，又名中華大棗、小棗，是鼠李科棗屬植物棗(Zizyphusjujuba Mill)的果實(shí)［1］。紅棗果肉營養(yǎng)豐富且含大量生物活性成分如大棗皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(ziziphussaponinⅠ，Ⅱ，Ⅲ)、酸棗仁皂甙B(jujuboside B)、光千金藤堿(stepharine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、環(huán)磷腺苷(cAMP)、環(huán)磷烏苷(cGMP)等，具有獨(dú)特的營養(yǎng)和藥用價(jià)值［2－5］。目前，除對(duì)棗肉中有效成分進(jìn)行研究外，對(duì)以往作為廢料丟棄的棗核中有效成分的研究也成為人們關(guān)注的課題［6－9］。研究表明，紅棗核含黃酮類成分具有預(yù)防心腦血管疾病、防癌抗癌之功效［8－9］。目前，天然產(chǎn)物中有效成分的傳統(tǒng)提取方法有醇滲漉法、浸漬法、索氏抽提法和加熱回流法，但存在提取時(shí)間長、溶劑用量大、提取率低等問題。近年來，現(xiàn)代提取技術(shù)超聲提取法在環(huán)境、生化、食品及天然產(chǎn)物等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于提取天然產(chǎn)物中揮發(fā)油、苷類多糖、生物堿等有效成分［10－14］。經(jīng)查閱，采用超聲法對(duì)紅棗核中黃酮類成分進(jìn)行提取的報(bào)導(dǎo)甚少［15］。為此，該實(shí)驗(yàn)以紅棗核為實(shí)驗(yàn)材料，采用正交實(shí)驗(yàn)法，利用超聲提取法對(duì)紅棗核中的總黃酮的提取進(jìn)行研究，旨在獲得最佳提取工藝，為紅棗核的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院;紅棗棗核樣品 河北滄州金絲小棗棗核;乙醇、氫氧化鈉分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;三氯化鋁分析純，天津市虹迪化工有限公司;亞硝酸鈉 分析純，天津市化學(xué)試劑一廠。

SK8200HP超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲有限公司;UV－2550型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;FA1604N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;ZK－82B型真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠;微孔過濾器 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［16］精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0mg，用50%的乙醇水溶液溶解并定容至50mL容量瓶中。分別取此溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00mL于25mL容量瓶中，加30%的乙醇水溶液至10mL，加入5%的NaNO20.30mL搖勻后靜置10min，加入10%AlCl30.30mL，搖勻后靜置10min，加入5% NaOH 4.00mL，加水至刻度搖勻，靜置15min，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在507nm處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁對(duì)照品溶液在此濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系，線性回歸方程為A= 0.01925+13.82C，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.0032～0.048mg·mL－1。

1.2.2 提取工藝流程 棗核→洗凈烘干→粉碎過200目篩→加入溶劑→超聲提取→0.45μm微孔濾膜過濾得澄清透明液體→減壓濃縮回收溶劑→真空干燥→得棗核黃酮提取物粗品→計(jì)算提取率→計(jì)算粗品中黃酮含量。

1.2.3 浸提條件的選擇 研究料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、溫度、提取時(shí)間和超聲波功率對(duì)棗核總黃酮提取的影響，首先做單因素實(shí)驗(yàn)考察以上條件對(duì)提取率的影響，然后采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化最佳工藝條件。用分光光度計(jì)測(cè)定507nm處吸光度值，根據(jù)

1.2.1 計(jì)算得到棗核中黃酮含量，作為棗核總黃酮提取指標(biāo)。

1.2.3.1 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液30、40、50、60、70mL作為溶劑，設(shè)定超聲波功率350W，提取溫度25℃，提取時(shí)間30min，進(jìn)行超聲波提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測(cè)定，在507nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。

1.2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，分別加入50.00mL乙醇溶液作為溶劑，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%，設(shè)定超聲波功率350W，提取溫度25℃，提取時(shí)間30min，進(jìn)行超聲提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測(cè)定，在507nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。

1.2.3.3 提取時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗核樣品各 1.0000g置于 250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定超聲波功率350W，提取溫度25℃，分別控制提取時(shí)間10、20、30、40、50min進(jìn)行超聲波提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測(cè)定，在507nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。

1.2.3.4 超聲波功率的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定超聲波功率分別為250、300、350、400、450W，提取溫度25℃，超聲提取30min，浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測(cè)定，在507nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。

1.2.3.5 提取溫度的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗核樣品各 1.0000g置于 250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定提取溫度分別為25、35、45、55、65℃，超聲波輻射溫度350W，超聲提取30min，浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測(cè)定，在507nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。

1.2.3.6 最佳工藝條件的選擇 為了獲得以乙醇溶液作為溶劑，超聲提取棗核總黃酮的最佳工藝條件，通過研究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲波功率和提取溫度等單因素，確定4個(gè)水平進(jìn)行L16(45)實(shí)驗(yàn)(表1)，以黃酮含量為指標(biāo)，探究超聲提取棗核總黃酮的最佳工藝條件。

表1 L16(45)正交因子水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 棗核黃酮粗品提取產(chǎn)率的計(jì)算 將浸提液減壓濃縮回收溶劑，將產(chǎn)品真空干燥得棗核黃酮粗品，粗品的提取產(chǎn)率計(jì)算公式為:

式中:ω為棗核黃酮粗品提取產(chǎn)率，%;X為棗核黃酮提取物粗品質(zhì)量，g;m為棗核質(zhì)量，g。

1.2.5 棗核黃酮粗品中黃酮含量的計(jì)算 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的黃酮粗品，溶解并定容至25mL容量瓶中，取一定體積溶液并按1.2.1測(cè)定吸光度，將吸光度換算成濃度，計(jì)算棗核粗品中黃酮含量。

式中:w為棗核粗品中黃酮純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，%;c為溶液中黃酮濃度，mg·mL－1;V為所取溶液體積，mL;M為棗核粗品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 料液比的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著溶劑量的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)料液比低于1∶50時(shí)，提取率隨著料液比的增大而升高，這是因?yàn)樘崛÷实母叩团c黃酮向溶劑擴(kuò)散的難易程度有關(guān)，料液比小，溶劑量少，導(dǎo)致兩相界面間的濃度差小，不利于黃酮的擴(kuò)散。但當(dāng)料液比高于1∶50時(shí)，提取率反而降低，不利用工業(yè)生產(chǎn)。因此，選定1∶30、1∶40、1∶50和1∶60作為正交實(shí)驗(yàn)中料液比的四個(gè)水平。

圖1 料液比對(duì)棗核黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid－liquid ratio on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，棗核中總黃酮的提取率先增大后減小。這是因?yàn)橐掖紝?duì)黃酮的溶解度比水大，乙醇對(duì)細(xì)胞的破壞作用比水強(qiáng)，在超聲波作用下表現(xiàn)得更加明顯。乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%時(shí)，棗核黃酮提取率較高，考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，選定30%、40%、50%和60%作為正交實(shí)驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)的四個(gè)水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)棗核黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖可知，隨著超聲作用時(shí)間的增加，棗核總黃酮的提取率迅速增大，可見提取時(shí)間越長，提取越充分。但時(shí)間超過30min后，黃酮提取率趨于穩(wěn)定。因此，選定10、20、30和40min作為正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的四個(gè)水平。

2.1.4 超聲波功率的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。由圖可知，棗核黃酮的提取率隨超聲波功率的增加而逐漸提高，這是因?yàn)殡S著超聲波功率的增大，超聲波的空化作用、粉碎作用使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，提高和改善了組織細(xì)胞的通透性;此外，超聲波的吸收使超聲波的動(dòng)能轉(zhuǎn)化為熱能，使得植物組織內(nèi)部溫度升高，有利于有機(jī)成分的溶出。但超聲波功率大于400W后，棗核黃酮的提取率隨超聲波功率的增加有所降低。因此，選定300、350、400和450W作為正交實(shí)驗(yàn)中超聲波功率的四個(gè)水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)棗核黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

圖4 超聲波功率對(duì)棗核黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic－wave power on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.5 提取溫度的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的上升，棗核中黃酮的提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，但溫度超過55℃，提取率趨于穩(wěn)定。分析原因是:從較低溫度升至60℃，熱效率升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，利于黃酮的破壁溶出;但隨著溫度的繼續(xù)升高，使部分蛋白凝固從而不利于黃酮溶出，故提取率趨于穩(wěn)定。據(jù)此，選定25℃、35℃、45℃和55℃作為正交實(shí)驗(yàn)中提取溫度的四個(gè)水平。

圖5 提取溫度對(duì)棗核中黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.6 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響棗核總黃酮提取因素中有意義的水平做正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳提取工藝條件。采用L16(45)正交因子水平表(見表1)，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2數(shù)據(jù)極差分析可知，RE＞RA＞RC＞RB＞RD，各因素對(duì)棗核中總黃酮的提取率的影響程度依次為:提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率，溫度對(duì)棗核黃酮提取的影響最為顯著，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，優(yōu)化得到超聲提取棗核黃酮的最佳條件為:A3B3C4D3E4，即料液比為1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為40min，超聲波功率為400W，提取溫度55℃。

表2 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 最佳工藝條件的驗(yàn)證

按A3B3C4D3E4條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下棗核中黃酮含量Table 3 Extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates under optimal condition with Orthogonal Test

由表3可知，A3B3C4D3E4條件下棗核黃酮提取率高于表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故A3B3C4D3E4為最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 棗核黃酮提取物粗品的制備

取3份棗核樣品各10.0000g，采用上述最佳提取條件進(jìn)行提取，得黃酮提取液，再按照1.2.2提取工藝流程，將該溶液進(jìn)行濃縮精制，得到棗核黃酮粗品，稱量計(jì)算得平均質(zhì)量為1.2451g，計(jì)算黃酮粗品提取產(chǎn)率為12.45%，該棗核黃酮粗品中黃酮含量為6.83mg·g－1，約為棗核樣品中黃酮含量的7.8倍。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選棗核黃酮的最佳提取工藝條件，在最佳實(shí)驗(yàn)條件:料液比1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間40min，超聲波功率400W，提取溫度 55℃，得到棗核黃酮粗品的提取率為12.45%，粗品中黃酮含量為6.83%。

3.2 實(shí)驗(yàn)利用超聲提取方法，可以極大地縮短提取時(shí)間，且能達(dá)到較高的提取效率。因此，超聲提取法是一種較為理想的提取方法，具有省時(shí)、高效、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)。

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Study on ultrasonic extraction of total flavone from seeds of Chinese dates with orthogonal test

ZHANG Ji－xiang1，OU Lai－liang2
(1.Faculty of Chemistry and Material Science，Langfang Teachers’College，Langfang 065000，China; 2.Key Laboratory of Bioactive Materials，Ministry of Education，Institute of Molecular Biology，Nankai University，Tianjin 300071)

The optimal condition for ultrasonic extraction of flavone from seeds of Chinese dates was investigated by orthogonal test.The total flavone content of seeds of Chinese dates was determined by using spectrophotometry method with rutin as reference substance.In the single factor analysis，the effect of ultrasonic－wave power，extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol(extraction solvent)volume fraction were measured.The orthogonal test was used to optimize the conditions of extraction.The results showed that the order of extraction effectiveness was as follows:extraction temperature＞solid－liquid ratio＞extraction time＞ethanol volume fraction＞ultrasonic－wave power.The optimum conditions were extraction temperature 55℃，solid－liquid ratio1∶50，extraction time 40min，ethanol volume fraction 50%，and ultrasonic－wave power 400W.Under the optimized extraction conditions，the yield of flavone crude product was 12.45%，the content of total flavone was 6.83mg·g－1.The results indicated that operating efficiency of extracting total flavone from seeds of Chinese dates was remarkably increased by orthogonal test and ultrasonic wave extraction.

orthogonal test;ultrasonic－wave;extraction;seeds of Chinese dates;total flavone

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0280－04

2011－09－08

張吉祥(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物中有效成分的提取與分離。

河北省教育廳青年基金資助項(xiàng)目(2010156)。