單核細胞增生李斯特菌復合抑菌劑的研究

潘利華，劉竹青，于 薈，陳有亮

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州310058)

單核細胞增生李斯特菌復合抑菌劑的研究

潘利華，劉竹青，于 薈，陳有亮*

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州310058)

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)在0～4℃也能生長，為確保冷卻肉衛生安全，必須阻止肉中污染的LM的生長繁殖。本實驗通過研究不同抑菌劑對3株LM的最小抑菌濃度(MIC)，選取了ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸三種抑菌劑，利用響應面法找出最佳組合。結果表明:ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸對單核細胞增生李斯特菌的最小抑菌濃度分別為50μg/mL、200μg/mL、6.4mg/mL。當ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸的濃度分別為20.5μg/mL、184.6μg/mL、4.37mg/mL時對單核細胞增生李斯特菌的抑制作用最佳。

ε－聚賴氨酸，Nisin，曲酸，響應面，單增李斯特菌

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種人畜共患的致病菌，能引起人類腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風險［1］。雖然發病率不高，但致死率(20%～30%)［2］遠高于其他常見食源性病原菌。LM已被WHO列為重點監測的食源性致病菌之一［3］。冷卻肉，是指嚴格執行檢疫制度宰殺后的溫熱畜肉，經過各種方法使其溫度迅速降至0～4℃，并在后續的分割加工、流通過程中始終處于0～4℃，不超過7℃的冷卻鏈控制下的生鮮肉［4］。在冷鏈條件下，酶的活性和大多數腐敗微生物的生長受到抑制，與其他微生物不同，LM在0～4℃也能生長［5］。冷卻肉要想達到衛生安全的目的，必須阻止冷卻肉中污染的LM的生長繁殖，而添加防腐劑是一種簡單、有效的方法。目前防腐劑分化學合成防腐劑和天然防腐劑，但經過長期的研究發現，一些合成防腐劑有致癌和致突變等問題，因此，開發高效、安全、穩定的天然防腐劑成為防腐劑研究的重要方向［6－7］。本實驗研究了ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸、溶菌酶、乳鐵蛋白、乳酸鈉6種抑菌劑對3株LM的最小抑菌濃度(MIC)，篩選出3種抑菌效果較好的抑菌劑，對3種抑菌劑在肉湯中進行三元二次旋轉回歸實驗設計，通過響應面法找出最佳抑菌劑濃度組合，旨在為其進一步在冷卻肉中應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

單增李斯特菌(EGDA、0013、10403S) 浙江大學動物預防醫學研究所提供;培養基 腦心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)干粉培養基;ε－聚賴氨酸和Nisin 食品級，浙江銀象生物工程有限公司;乳酸鈉 分析純，上海展云化工有限公司;曲酸 食品級，成都拉克生物工程有限公司;溶菌酶 食品級，杭州中香化學有限公司;乳鐵蛋白 食品級，南京紐瑞氏食品有限公司。

1.2 實驗方法

表2 不同抑菌劑對單增李斯特菌的MICTable 2 MICs of different bacteriostatic agents against LM

1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測定［8］

1.2.1.1 抑菌劑母液的配制及其倍比稀釋 抑菌劑母液的配制:用無菌蒸餾水配制12.8mg/mL的Nisin、溶菌酶、ε－多聚賴氨酸、乳鐵蛋白;配制25.6mg/mL的曲酸和乳酸鈉，搖勻，放于冰箱備用。

倍比稀釋:將抑菌劑母液用無菌水以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048倍稀釋。

1.2.1.2 菌懸液的制備 取細菌37℃搖床培養10～12h。用 BHI液體培養基調整濃度至108CFU/mL (OD600=0.15)，將菌液稀釋至107CFU/mL，振蕩混勻，4℃備用。

1.2.1.3 MIC的測定 將倍比稀釋后不同濃度的抑菌液分別加到無菌的96孔酶標板中，第1至第11孔加抑菌液，每孔加100μL，第12孔不加抑菌液作對照組，再向每孔中加100μL制備的菌懸液，密封后置37℃培養。用酶標儀從0h開始每隔2h測量菌液的OD630，檢測至第12h。做OD－t生長曲線，通過觀察曲線，以單增李斯特菌不生長的最低濃度為MIC。

1.2.2 響應面法優化實驗

1.2.2.1 菌懸液的制備 取三株單增李斯特菌(10403S、EGD、0013)37℃過夜培養物，調整菌液濃度至108CFU/mL(OD600=0.15)，將三株單增李斯特菌振蕩均勻，4℃備用。

1.2.2.2 實驗設計 按照三元二次回歸通用旋轉組合設計添加ε－多聚賴氨酸、Nisin和曲酸的用量，實驗因素水平表見表1，同時設空白對照組，共21組實驗。然后取制備好的菌液分裝于各組試管，每個試管50μL，最后用BHI營養肉湯補足5mL，初始菌液濃度為106CFU/mL。將試管于10℃下冷藏放置5d，從0d起，每天每組取2個試管進行計數。

表1 響應面實驗因素水平表Table1 Factors and levels of RAS test

1.2.3 數據統計與分析 所得數據用SAS軟件(8.2版)進行分析，擬合出模型，并通過降維分析各因素間的交互作用［9］。

2 結果與分析

2.1 不同抑菌劑對單增李斯特菌的MIC

不同抑菌劑對單增李斯特菌的MIC見表2。由表2可知，抑菌效果最好的是ε－聚賴氨酸，對3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，其MIC分別為200和6400μg/mL以下。而乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白的抑菌效果不明顯。本實驗中，雖然ε－聚賴氨酸和Nisin的抑菌效果較好，但是ε－聚賴氨酸和Nisin的價格較高，曲酸價格便宜，因此，選取ε－聚賴氨酸、Nisin和曲酸作為回歸實驗的抑菌劑，以期得到復合抑菌劑。

2.2 各組5d內菌落總數的變化

對在10℃下冷藏的21組BHI營養肉湯以5d為周期進行菌落總數的檢測，其中第21組為對照組，結果見表3。由表3可以看出，除第13處理組是緩慢增長外，其他處理組單增李斯特菌的生長基本都被抑制，第8組是菌數降低最快的一組。對照組明顯增加，菌落總數從106CFU/mL增長到109CFU/mL。

2.3 三元二次回歸通用旋轉組合設計實驗結果

三元二次回歸通用旋轉組合實驗設計及第3d菌落數的對數值如表4所示。

表4 實驗設計及結果Table 4 Experimental design and results

2.3.1 回歸模型與統計檢驗 用SAS(8.2版)軟件的RSREG過程對表4中數據進行多元回歸分析。所得二次回歸方程:

表3 各組在10℃下冷藏5d內菌落總數的變化(CFU/mL)Table 3 Changes in total bacteria counts of 21 samples stored at 10℃(CFU/mL)

為了說明模型的有效性和各因素對抑菌效果影響的重要程度，對二次回歸方程模型進行方差分析，結果見表5。由方差分析表可知，失擬項的F=0.78，P=0.6029＞0.05，表明失擬項不顯著，說明未知因子對實驗結果干擾很小;回歸模型的F=25.62，P＜0.0001，表明回歸方程模型極顯著，說明該模型與實際情況擬合效果很好，可以正確反映菌落數與ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸三因素間的關系。為了說明各因素對抑菌效果的貢獻大小，對各偏回歸系數進行了顯著性檢驗，結果見表6。表6表明，在編碼區間內，Nisin、曲酸的添加量對菌落數有極顯著影響，ε－聚賴氨酸的添加量對菌落數無顯著影響，但ε－聚賴氨酸和Nisin添加量的交互項對菌落數有顯著影響。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 ANOVA for quadratic model

2.3.2 單因子效應分析 觀察某因子變化對Y值的影響，可采用降維分析的方法，將其它因子固定在0水平，3個因子的單因子效應方程如下:

根據以上方程，可得到單因子效應曲線如圖1所示。

表6 回歸系數顯著性檢驗表Table 6 Significance test of regression coefficient

由圖1可知，當X1編碼為+0.55，即ε－聚賴氨酸添加量為33.2μg/mL;X2編碼為+1.682，即Nisin添加量為200μg/mL;X3編碼為+1.18，即曲酸添加量為5.12mg/mL，菌落總數分別為極小值。在取得極小值之前，菌落總數與防腐劑的百分比均為負相關;取得最小值之后，菌落總數與防腐劑的百分比均為正相關。

圖1 單因子效應曲線Fig.1 Effect of single factor on the colony count

2.3.3 交互效應分析 采用降維分析，令某因素水平值為0，就可以得到其他兩個因素對菌落數的二元二次方程。根據回歸方程繪制ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸3個因素對菌落數Y影響的響應面圖，見圖2～圖4。

圖2 ε－聚賴氨酸和Nisin的響應面曲線Fig.2 The response surface of ε－polylysine and Nisin

圖3 ε－聚賴氨酸和曲酸的響應面曲線Fig.3 The response surface of ε－polylysine and kojic acid

圖4 Nisin和曲酸的響應面曲線Fig.4 The response surface of Nisin and kojic acid

響應面圖可反映響應值對于處理條件改變的敏感性，從另一個方面也說明因素間交互作用的強弱。由圖2～圖4可知ε－聚賴氨酸和Nisin的之間交互作用相對于其他因素之間的交互作用最大，而ε－聚賴氨酸和曲酸之間的交互作用最小。

2.3.4 最佳配比的確定 為確定各因素的最佳取值，利用SAS軟件進行嶺脊分析［10］，根據分析可得菌落總數得到最低水平時3種抑菌劑的各自編碼值，即X1=－0.30，X2=1.41，X3=0.76。換算成實際值，即當聚賴氨酸添加量為 20.5μg/mL，Nisin添加量為184.6μg/mL，曲酸添加量4.37mg/mL時，單增李斯特菌的對數值可達最小值1.95，此時抑菌效果最佳。

3 討論

3.1 不同抑菌劑對單增李斯特菌的MIC

本實驗中，抑菌效果最好的是ε－聚賴氨酸，對3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，而乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白的抑菌效果不明顯。倪清艷［11］等人采用牛津杯法和平板稀釋法測定了ε－多聚賴氨酸對常見菌的抑菌特性;探討了其經高溫處理后及與其它防腐劑復合后的抑菌特性，結果顯示，ε－多聚賴氨酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為40、45、450mg/L;不同溫度處理后的抑菌效果基本沒有變化。說明其具有較好的熱穩定性能。郭良輝［12］等人研究了Nisin與溶菌酶復合生物保鮮劑對蚌肉的保鮮效果，通過對感官指標、揮發性鹽基氮和細菌總數等指標進行考察，從實驗結果來看，溶菌酶和Nisin等對蚌肉的防腐保鮮效果都好于對照組，而且Nisin與溶菌酶復配后效果更好，從實驗中還得出Nisin具有一定的抑制脂肪酸敗的效果。蘇國成［13］等人針對曲酸對于食品中常見污染菌的抑制作用進行系統研究，確定了曲酸對各種供試菌最小抑菌濃度，即曲酸對大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母菌和啤酒酵母菌的MIC分別是0.3%、0.4%、0.2%、0.4%、0.2%和0.5%。國內外關于ε－聚賴氨酸、Nisin、曲酸、乳酸鈉、溶菌酶、乳鐵蛋白針對單增李斯特菌的MIC的文獻報道較少，本實驗明確了不同抑菌劑對單增李斯特菌的MIC。

3.2 復合抑菌劑對單增李斯特菌的影響

加了抑菌劑的各組BHI營養肉湯，其微生物的生長基本受到抑制，而未加抑菌劑的對照組，微生物數明顯增加，從106CFU/mL增長到109CFU/mL。說明本實驗的處理對單增李斯特菌的生長有明顯的抑制效果，可為進一步在冷卻肉中應用提供科學依據。

以菌落總數作為指標來看各抑菌劑的抑菌效果，結果依次是曲酸、Nisin和ε－聚賴氨酸。說明在編碼區間內，曲酸的添加量對抑菌效果的影響最為顯著。1947年，Mattick和Hirsch證明Nisin可抑制許多革蘭氏陽性菌［14］，本實驗中，單增李斯特菌為革蘭氏陽性菌，Nisin對其抑制效果達到極顯著水平(P＜0.01)，這與前人的報道相一致。李鳳梅［15］采用圓濾紙片法研究曲酸與ε－聚賴氨酸復合抑菌效果。結果顯示，復合后對金黃色葡萄球菌抑菌效果具有協同增效作用。本實驗中，從ε－聚賴氨酸與曲酸的響應曲面圖可知，兩者的交互作用顯著。

4 結論

4.1 抑菌效果最好的是ε－聚賴氨酸，對3株單增李斯特菌的MIC均為50μg/mL，抑菌效果次之的是Nisin和曲酸，其MIC分別為200和6400μg/mL以下。

4.2 當ε－聚賴氨酸添加量為20.5μg/mL，Nisin添加量為184.6μg/mL，曲酸添加量4.37mg/mL時，對數值可到達最小值1.95，此時抑菌效果為最佳。ε－聚賴氨酸和Nisin有交互作用。

［1］Mook P，O＇Brien SJ，Gillespie IA.Concurrent conditions and human Listeriosis，England，1999－2009［J］.Emerging Infectious Diseases，2011，17(1):38－43.

［2］MarcusR.New information aboutpediatricfoodborne infections:the view from FoodNet［J］.Current Opinion in Pediatrics，2008，20(1):79－84.

［3］吳蜀豫，李迎惠，冉陸，等.中國2001年11省市食品中李斯特菌污染狀況的主動監測［J］.中華流行病學雜志，2003，24 (8):657－659.

［4］孔保華.畜產品加工［M］.北京:科學出版社，2007.

［5］李波，喬鳳，方麗，等.PCR方法檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌［J］.吉林大學學報:醫學版，2006，32(1): 154－156.

［6］Patricia L P，Cristina S，Ramon B，et a1.Vapor—phase activities of cinnamon，thyme，and oregano essential oils and key constituents against foodborne microorganisms［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55:4348－4356.

［7］Shan B，Cai Y Z，Brooks J D，et al.Antibacterial properties and major bioactive components of cinnamon Stick(Cinnamomum burmannii):activity against foodborne pathogenic bacteria［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55:5484－5490.

［8］陳南南，徐歆，商豐才，等.不同防腐劑對3種模式腐敗菌抑菌效果的比較［J］.食品科學，2011，32(1):14－18.

［9］朱世武.SAS編程技術教程［M］.北京:清華大學出版社，2007:75－78.

［10］Shieh C J，Liao H F，Lee C C.Optimization of lipasecatalyzed biodieselby response surface methodology［J］. Bioresource Technology，2003，88(2):103－106.

［11］倪清艷，李燕，張海濤.ε－多聚賴氨酸的抑菌作用及在保鮮中的應用［J］.食品科學，2008，29(9):102－105.

［12］郭良輝，許巧情，許永久.溶菌酶與Nisin復合生物保鮮劑對蚌肉的保鮮效果［J］.水利漁業，2007，27(4):112－114.

［13］蘇國成，湯鳳霞，楊秋明.曲酸對常見食品污染菌的抑制作用［J］.食品與發酵工業，2005，31(3):47－51.

［14］Rutt Suttisri，IK－Soo Lee，A Douglas Kinghorn.Plantderived triterpenoid sweettness inhibitors［J］.Journalof Ethnopharmacology，1995，47:9－26.

［15］李鳳梅.曲酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用研究［J］.食品研究與開發，2008，29(6):190－192.

Study on composite antibacterial agents for Listeria monocytogenes

PAN Li－hua，LIU Zhu－qing，YU Hui，CHEN You－liang*
(College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

We had to prevent the growth and proliferation of LM which contaminated the meat to ensure the safety of chilled meat，as Listeria monocytogenes can grow at 0～4℃.We studied the minimum inhibitory concentration(MIC) of different bacteriostatic agents against LM，selected ε－polylysine，Nisin and kojic acid，and found their best combination by response surface method.The results showed that the MIC of ε－polylysine，Nisin，kojic acid against LM was 50μg/mL，200μg/mL and 6.4mg/mL.The best bacteriostatic effect of LM under the concentration of ε－polylysine，Nisin，kojic acid was 20.5μg/mL，184.6μg/mL and 4.37mg/mL.

ε－polylysine;Nisin;kojic acid;response surface;Listeria monocytogenes

TS202.3

A

1002－0306(2012)08－0344－05

2011－08－12 *通訊聯系人

潘利華(1987－)，女，碩士，研究方向:食品安全。

“十一五”國家科技支撐計劃(2009BADB09－5)。