薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

韓 瑞，王賢磊，高興旺，鐘 俐

(新疆大學，生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

韓 瑞，王賢磊，高興旺，鐘 俐*

(新疆大學，生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

采用Trizol法從12℃處理48h的10d齡薄荷葉片中提取總RNA，通過RT－PCR方法擴增獲得薄荷醇合成關鍵酶基因cDNA(命名為LT，ST)，連接到pMD18－T載體上，命名為pMD18－T－LT，pMD18－T－ST。結果表明:擴增的薄荷醇合成酶片段全長約1125bp和942bp。將獲得的基因成功構建到植物表達載體pCAMBIA1301上，經轉化根癌農桿菌GV3101，經菌落PCR進一步鑒定轉化結果。實驗結果為進一步從分子水平挖掘并利用薄荷醇合成酶關鍵基因奠定基礎。

薄荷，薄荷醇合成酶，基因克隆

1 材料與方法

1.1 實驗材料

薄荷(M.haplocalyx Briq) 由中國工程院吳明珠院士提供;大腸桿菌 DH5α，植物表達載體pCAMBIA1301，根癌農桿菌 GV3101;Trizol，DEPC，Hygromycin，PCR相關試劑;引物 由Takara公司合成;反轉錄試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，pMD18－T vector試劑盒，限制性內切酶Sal I，Sam I，T4DNA連接酶，PCR引物;YEB固體培養基 含50mg/L Kan，50mg/L Rif，50mg/L Gen。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

1.2.1.1 植物材料的處理 取適量干燥的薄荷種子在超凈工作臺中加入75%的乙醇浸泡10min，用滅菌蒸餾水漂洗播布于MS固體培養基，4℃純化7d后移至光照培養箱中進行光照培養，培養條件為:光照16h，25℃/黑暗8h，19℃;待長出2片真葉，移栽到蛭石/珍珠巖≈3∶1培養基質中光照培養。

1.2.1.2 總RNA的提取 采用Trizol法［14］提取薄荷總RNA，保存于－80℃冰箱待用。

1.2.1.3 cDNA的合成 取11μL RNA為模板，加入相應的試劑與引物，反轉錄條件:42℃，60min;70℃，10min，冰上冷卻，合成cDNA第一鏈。以反轉錄產物為模板進行PCR擴增目的cDNA的第二條鏈，PCR反應條件:(LT)94℃，5min;94℃，30s;40℃，40s; 72℃，60s;72℃，7min，35循環;(ST)94℃，5min; 94℃，30s;50℃，40s;72℃，60s;72℃，7min，35循環。1.2.1.4 引物設計 以Genbank中公布的薄荷醇合成關鍵酶基因序列為模板，用Primer Premier 5軟件設計特異引物。……