離體大鼠腸內(nèi)菌群對知母甾體皂苷代謝研究

張鈺哲

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

離體大鼠腸內(nèi)菌群對知母甾體皂苷代謝研究

張鈺哲

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：觀察大鼠腸內(nèi)菌對知母主要活性成分甾體皂苷的代謝及對相應(yīng)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。方法：離體培養(yǎng)大鼠腸道菌群，用LC/MS/MS法檢測離體腸內(nèi)菌對甾體皂苷樣品的代謝產(chǎn)物。灌胃給予大鼠甾體皂苷樣品15 mg·kg-1，于給藥后不同時(shí)間采集尿樣及糞樣，用LC/MS/MS法檢測甾體皂苷樣品的代謝產(chǎn)物。對主要代謝物M1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。用合成的方法制備代謝物M1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行LC/MS/MS法分析并與大鼠離體和在體樣品對比。結(jié)果：甾體皂苷樣品容易被大鼠消化道菌群代謝，代謝速率很快，其主要代謝產(chǎn)物為代謝物M1，隨著代謝時(shí)間的延長，代謝物M1的量逐漸增多，而甾體皂苷樣品的量則下降迅速。結(jié)論：甾體皂苷可被大鼠腸內(nèi)菌迅速代謝。

甾體皂苷；腸內(nèi)菌群；代謝物；液-質(zhì)聯(lián)用法

甾體皂苷（steroidal saponin）是由螺甾烷類化合物衍生的寡糖苷，是一類重要的中藥活性成分，許多常用中藥如重樓、黃精、薤白、知母、蒺藜、穿山龍、麥冬等都含有甾體皂苷。研究表明，甾體皂苷具有改善心血管活性，抗癌、抗癡呆、抗病原微生物、降血糖及雌激素樣作用。許多主要含甾體皂苷的中成藥早已上市，如地奧心血康膠囊、心腦舒通、冠心寧、宮血寧及金剛藤膠囊等。甾體皂苷已成為藥物研究開發(fā)的重要先導(dǎo)化合物。目前發(fā)現(xiàn)中藥中含有兩個(gè)糖鏈的水溶性甾體皂苷具有顯著上調(diào)膽堿能n受體數(shù)量、改善腦循環(huán)、防治老年性癡呆等作用。經(jīng)構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)呋甾皂苷單體化合物有一定的抗癡呆效果。口服甾體皂苷可顯著改善多種擬癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能，并觀察到甾體皂苷對模型動(dòng)物的腦源性神經(jīng)生長因子（Brain-derived growth factor，BDNF）、細(xì)胞間黏附分子（Intercellular adhesion molecule，ICAM）、血管細(xì)胞黏附分子（Vascular cell adhesion molecule，VCAM）、腦組織超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量的顯著調(diào)節(jié)作用。甾體皂苷改善學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)理，一方面是通過上調(diào)膽堿能n及m受體，另一方面是通過擴(kuò)張血管、抑制血栓形成、改善腦缺血及其損傷實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過充分的藥效學(xué)研究擬將其開發(fā)為抗老年性癡呆中藥的一類新藥。然而藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，原形藥物的生物利用度非常低，小于1%，提示應(yīng)對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。口服藥物的代謝主要通過肝臟和腸道菌群，而中藥等天然化合物的代謝與腸道微生菌群關(guān)系密切。天然皂苷腸道代謝的研究以日本學(xué)者小橋恭一教授為先導(dǎo)者，他先后證明人參皂苷、甘草皂苷等多種中藥皂苷口服大多經(jīng)腸道內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化或代謝后所產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物入血發(fā)揮其療效。并提出了天然前藥的概念〔1〕。本文研究了活體和離體狀態(tài)下大鼠腸內(nèi)菌群對甾體皂苷樣品的代謝并鑒定其代謝產(chǎn)物，提供主要代謝產(chǎn)物的時(shí)－量變化關(guān)系。方法采用液-質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）。目前文獻(xiàn)中對皂苷等天然化合物的代謝研究方法通常為薄層板分離后再用質(zhì)譜進(jìn)行檢測。此種方法靈敏度較低，測定時(shí)基質(zhì)干擾嚴(yán)重，本研究經(jīng)過方法摸索，建立了更靈敏的液-質(zhì)聯(lián)用法，能夠同時(shí)提供色譜峰面積和分子量、子離子碎片信息。研究腸內(nèi)菌群對甾體皂苷樣品的代謝及鑒定其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，對進(jìn)一步研究代謝產(chǎn)物的活性，闡明其藥理作用的真正分子基礎(chǔ)有重要意義。

本研究所使用的甾體皂苷樣品的分子式為C45H76O19，分子量為920，其結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 樣品甾體皂苷結(jié)構(gòu)式

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，體重180～200 g，由大理學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Finnigan公司LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀，配有離子噴霧離子源以及Xcalibur1.4軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Agilent 1100高效液相色譜輸液泵，Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為Thermo betabase-18 C18分析柱，I.D.2.1×100 mm，5 mm粒徑，美國Thermo公司。

1.3 試劑 知母皂苷化合物BⅡ（規(guī)格：HPLC≥ 98%）；代謝物M1標(biāo)準(zhǔn)品（薩爾薩皂苷元），購自上海華壹生物科技有限公司；產(chǎn)氣袋、密封袋購自Mitsubishi Gas Chemcal Co.Inc；其他化學(xué)試劑：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸銨、氯化鈣、硫酸鎂、resazurine、L-cysteine、牛肉膏、蛋白胨，以上試劑均為分析純。為天津福晨化學(xué)試劑廠和北京化工廠產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 厭氧培養(yǎng)液的組成及制備 取37.5 mL溶液A （0.78%K2HPO4）；37.5 mL溶 液 B（0.47% KH2PO4，1.18%NaCl，1.2%（NH4）2SO4，0.12%Ca－Cl2，0.25%MgSO4H2O）；0.1%resazurine 1 mL；L-cysteine 0.5 g；25%L-ascorbic acid 2 mL；8%Na2CO350 mL；牛肉膏1 g；蛋白胨1 g和營養(yǎng)瓊脂1 g；加蒸餾水至1 L；最后調(diào)pH 7.5～8.0，其他試劑均為分析純〔2〕。

1.4.2 離體培養(yǎng)腸內(nèi)菌群對樣品的代謝 取健康大鼠新鮮糞便，按1 g∶4 mL的比例將糞便與生理鹽水混合制成懸濁液，取0.5 mL新鮮配制的糞便懸濁液，加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液4.5 mL，混勻，得到5 mL腸菌培養(yǎng)液。取此新鮮配制的腸菌培養(yǎng)液12份，其中6份各加入樣品5 mg為實(shí)驗(yàn)組。另外6份不加樣品，為空白對照組。置于37℃厭氧培養(yǎng)罐（產(chǎn)氣袋法：將產(chǎn)氣袋打開放入培養(yǎng)袋中就會(huì)自動(dòng)與空氣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生CO2，在密閉罐內(nèi)局部造成缺氧環(huán)境，用于腸道厭氧菌培養(yǎng)）中培養(yǎng)，于2、4、8、12、24、36 h取菌群懸液與乙腈按1∶3的比例混合，高速離心10 min，取上清液置高效液相樣品瓶中，40 μL進(jìn)樣，LC/MS/MS檢測。

1.4.3 大鼠在體腸內(nèi)菌群對樣品代謝糞便及尿樣采集與處理〔3-4〕Wistar大鼠6只，雌雄各半，大鼠分別置代謝籠中，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，并同時(shí)收集空白尿樣和糞樣；按15 mg·kg-1灌胃給予樣品，給藥后兩小時(shí)讓大鼠進(jìn)食。分別收集給藥后0～12、12～24、24～48、48～96 h各時(shí)間段的尿樣及糞樣，糞便晾干后研磨混勻，取適量用乙腈浸泡提取過夜。提取液處理同離體菌群懸液。

1.4.4 LC-MS/MS法的分析條件 質(zhì)譜條件：離子噴射電壓4.5 kV；毛細(xì)管電壓44 V；溫度為270℃；鞘氣22 L·min-1；輔助氣5 L·min-1；掃氣2 L·min-1，負(fù)離子檢測。掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）方式。色譜條件：Thermo betabase-18 C18分析柱，I.D.2.1×100 mm，5 mm粒徑，梯度洗脫方式。流動(dòng)相：甲醇-乙腈（50：50，v/v），水，流速0.2 mL·min-1，柱溫25℃。流動(dòng)相梯度變化見表1。

表1 流動(dòng)相梯度變化

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 離體培養(yǎng)大鼠腸道菌群對知母甾體皂苷化合物的代謝 LC-MS/MS法分析結(jié)果顯示，樣品容易被大鼠腸內(nèi)菌群代謝。腸內(nèi)菌懸液與樣品在厭氧狀態(tài)下孵育2 h時(shí)，除保留時(shí)間為7.9 min的樣品色譜峰外，還出現(xiàn)了保留時(shí)間為12.3 min的代謝物，稱之為M1。M1對應(yīng)的質(zhì)譜圖顯示（見圖3），其分子離子峰質(zhì)荷比m/z∶739.7，二級子離子質(zhì)荷比m/z∶577.6，根據(jù)樣品結(jié)構(gòu)推測M1的結(jié)構(gòu)為26位糖鏈脫去并與22位羥基環(huán)合的產(chǎn)物（分子式：C39H64O13結(jié)構(gòu)見圖2）。通過化學(xué)手段制備的代謝物M1標(biāo)準(zhǔn)品（經(jīng)過核磁共振分析確證結(jié)構(gòu)），LC-MS/MS法分析，獲得的總離子色譜圖及二級質(zhì)譜圖（見圖4）。圖3與圖4對比，保留時(shí)間及二級質(zhì)譜圖幾乎完全一致，佐證M1結(jié)構(gòu)如圖3所示。孵育不同時(shí)間腸內(nèi)菌懸液中樣品和代謝物M1的色譜峰面積變化如表2所示。代謝物M1自孵育2h時(shí)即產(chǎn)生，隨后逐漸增多，8 h時(shí)峰面積最大，隨后緩慢減少。樣品在孵育2 h時(shí)尚有較高濃度，隨后濃度迅速下降，8 h時(shí)濃度基本降至谷底。說明樣品經(jīng)口服給藥后腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化非常迅速，絕大部分轉(zhuǎn)化為代謝物M1。

圖2 代謝物M1結(jié)構(gòu)式（C39H64O13）

圖3 腸內(nèi)菌群懸液中代謝產(chǎn)物總離子色譜圖及M1的對應(yīng)二級質(zhì)譜圖

圖4 M1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及對應(yīng)二級質(zhì)譜圖

表2 孵育不同時(shí)間腸內(nèi)菌懸液中樣品和代謝物M1的色譜峰面積變化

圖5 孵育不同時(shí)間腸內(nèi)菌懸液中樣品和代謝物M1色譜峰面積曲線

2.2 在體大鼠腸內(nèi)菌群對樣品的代謝 大鼠給藥后，分析各個(gè)時(shí)間段收集的糞便樣品色譜及質(zhì)譜圖（典型圖譜如圖3），樣品經(jīng)腸道菌群代謝后，糞便中已無樣品而主要為代謝物M1，與樣品經(jīng)體外培養(yǎng)的腸道菌群代謝后無明顯差異，質(zhì)譜圖相似。如圖6所示。

圖6 體外菌群培養(yǎng)2 h后提取離子在30 min飛行時(shí)間內(nèi)代謝物的典型色譜圖及對應(yīng)質(zhì)譜圖

由2.1及2.2可知樣品經(jīng)體外腸道菌群和在體大鼠腸內(nèi)菌群的代謝產(chǎn)物均為M1，且隨著代謝時(shí)間的延長，代謝物M1的量逐漸增多，而甾體皂苷樣品的量則下降迅速。

3 討論

糖類知母甾體皂苷化合物是腸道內(nèi)細(xì)菌重要的碳源，因此，腸道內(nèi)細(xì)菌的苷鍵水解酶系對具有糖苷鍵的藥物進(jìn)行水解是腸道內(nèi)細(xì)菌代謝的一大特征〔5-6〕。本研究的結(jié)果揭示了樣品生物利用度低的原因。樣品經(jīng)口服給藥后在腸道內(nèi)即被菌群迅速轉(zhuǎn)化，主要為代謝物M1。有小部分M1再脫糖的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)未確定。少量原形被吸收入血，而代謝物M1隨后經(jīng)糞便排出。色譜圖中代謝物M1為保留時(shí)間非常接近的雙峰，雙峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖顯示分子離子質(zhì)荷比和子離子質(zhì)荷比均為739.7及577.6。推測他們是一對結(jié)構(gòu)較為相似的同分異構(gòu)體。M1是否入血及入血量多少，需再對血樣進(jìn)行代謝物研究。發(fā)揮樣品藥效學(xué)的真正活性分子及腸道內(nèi)具體代謝菌株尚待進(jìn)一步研究。

〔1〕李藝，蔣建東.中國藥用天然產(chǎn)物有效成分的代謝研究進(jìn)展〔J〕.中國中藥雜志，2010，35（23）：3223-3232.

〔2〕張怡紅，李華沖.離體培養(yǎng)人腸道菌群對黃山藥總皂苷的代謝研究〔J〕.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（14）：6-8.

〔3〕陳新梅.大鼠腸道酶和菌群對人參皂苷Rg1的代謝轉(zhuǎn)化研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：210-212.

〔4〕徐文，張亞平，張衛(wèi)東，等.離體大鼠腸道菌群對淫羊藿苷的代謝研究〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8（6）：98-106.

〔5〕Akao T，Che Q M，KyoichiK，et al.A Purgative Action of Barbaloin is Induced by Eubacterium sp Strain BAR，a Human Intestinal Anaerobe，Capable of Transforming Barbaloin to Aloeemodin Anthrone〔J〕.Bio Pharm Bull，1996，19（1）：136-138.

〔6〕趙鐘祥，李美芬，林朝展，等.大鼠腸內(nèi)菌對毛冬青皂苷ilexsaponin A1的代謝轉(zhuǎn)化〔J〕.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（4）：329-332.

In Vitro Study of Rat Coliform Bacteria Metabolism of Steroidal Sponin Extract from Anemarrhena asphodeloides

ZHANG Yuzhe
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the metabolism of steroidal saponins extracted from Anemarrhena asphodeloides in rat intestinal flora in vitro and to identify the major metabolite.Methods:Rat intestinal flora and steroidal saponins extractions were incubated in vitro, and LC/MS/MS method was used to examine metabolites of steroidal saponins.The urine samples and dungs of the rats were collected after the rats were given with steroidal saponins extract in dose of 15 mg·kg-1by gavage.The metabolites of the steroidal saponins were detected with LC/MS/MS,and the structure of the major metabolite M1 was identified.Meanwhile,the M1 obtained from synthesis was compared with the natural M1 both in vitro and in vivo.Results:In vitro,steroidal saponins extracted from A. asphodeloides were metabolized easily by rat intestinal flora,and the metabolic rate was very quickly,and the major metabolite was M1.The metabolite M1 increased gradually with the prolongation of incubation time,but the quantity of steroidal saponins extract were dropped quickly.Conclusion:Steroidal saponins extracted from A.asphodeloides are metabolized easily by rat intestinal flora.

steroidal saponins;intestinal flora;metabolism;LC/MS/MS

R286.2［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0005-04

2011-11-18

2012-03-01

張鈺哲，碩士，助教，主要從事藥代及分子藥理學(xué)研究.

（責(zé)任編輯 毛本勇）