乙肝病毒基因組1896位點變異株與野生株的快速檢測

郭龍華，陳 茶，萬澤民，何文軍，吳新忠，周 強，馮春顏，吳文權

（1.深圳市龍華人民醫院 檢驗科，廣東 深圳518109；2.廣東省中醫院 檢驗科，廣東 廣州510120）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）前C區定位于乙肝病毒基因組nt1814－1900，前C區是HBV基因組的高變區，前C區最常見的變異為G1896A點突變，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導致HBeAg陰轉，影響干擾素療效［1］。目前一些常用方法對前C區1896位點變異株與野生株的混合感染易漏檢，本研究建立的熒光定量PCR法能快速檢測乙肝病毒基因組1896位點變異株與野生株的混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本來源于本院門診和住院病人。

1.1.2 主要儀器 Roche公司LightCycler型熒光定量PCR儀、法國VL公司Bio－1D型凝膠成像儀、日本島津（Shimadzu）UV－2550型紫外可見分光光度計。

1.1.3 主要試劑 廣州達安基因公司HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（國產），裂解液（自配）。Taq DNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、DNA Marker（TaKaRa公司）、PMD18－T載體（TaKaRa公司）。

1.1.4 參照GenBank中的HBV基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設計5條特異性引物和1條特異性探針，由上海英駿生物技術有限公司合成。

P1：5－GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG－3′（nt 1669－1688）；

P2：5－TTG CCT GAG TGC GGT ATG GTG A－3′（nt 2071－2050）；

P3：5－TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC A－3′（nt 1825－1846）；

P4：5－TCA ATG TCC ATG CCC C－3′（nt 1911－1896）；

P5：5－TCA ATG TCC ATG CCC T－3′（nt 1911－1896）（針對突變株）；

TaqMan熒 光 探 針 ：5′－ （FAM）－CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG G－（TAMRA）－3′（nt 1891－1870）。

1.2 方法

1.2.1 收集30例 HBV DNA含量高于1×103IU／ml血清標本（用廣州達安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測）。

1.2.2 HBV DNA 的提取方法參照文獻［2］。

1.2.3 第一次PCR擴增：引物P1、P2（5μmol／L）各1μl，10×緩沖液2μl，dNTP（10mmol／L）0.4 μl，Taq DNA 酶（1U／μl）0.5μl，MgCl2（25mmol／L）0.4μl，模板2μl，ddH2O 12.7μl，總體積20μl，95℃5分鐘。然后94℃0.5分鐘，53℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘共循環35次，72℃延伸5分鐘。取PCR產物在1.2%瓊脂凝膠（含EB）上電泳，觀察結果。

1.2.4 用試劑盒回收和純化PCR產物，然后克隆入PMD18－T載體轉化到大腸桿菌DH5α，將篩選出的陽性重組質粒送上海英駿生物技術有限公司用M13通用引物正反測序，分別選出含變異株和野生株序列重組質粒的大腸桿菌DH5α增菌，提取和純化質粒，檢測A260和A280值，計算質粒樣品濃度（μg／μl），換算出質粒拷貝數濃度（IU／ml），分別稀釋成1×103IU／ml、1×104IU／ml、1×105IU／ml、1×106IU／ml作標準模板備用。

1.2.5 熒光定量PCR擴增 每個標本同時做2個擴增管，一管加P3、P4（5μmol／L）各1μl，另一管加P3、P5（5μmol／L）各1μl，其余所加成份相同，10×緩沖液2μl，dNTP（10mmol／L）0.4μl，Taq DNA酶（1U／μl）0.5μl，MgCl2（25mmol／L）0.4μl，Taq－Man熒光探針 0.1μl（50μmol／L），模板 2μl，ddH2O 12.6μl，總體積20μl，94℃5分鐘。然后94℃20秒，55℃45秒，共循環40次。

1.2.6 熒光定量PCR標準曲線 上述稀釋好的標準模板（野生株質粒和變異株質粒）作擴增模板，野生株質粒用引物P3、P4，變異株質粒用引物P3、P5，其余擴增條件相同，調整基線以試劑空白和陰性管不出現陽性為準，與基線的交點的循環次數（Ct）值為縱坐標，HBV DNA濃度的對數值為橫坐標，儀器自動繪制標準曲線，利用待測標本的Ct值求出相應的HBV DNA含量。

1.2.7 靈敏度檢測 選取1份用廣州達安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測HBV DNA含量為5×106IU／ml血清標本，用HBV陰性血清1∶5倍連續稀釋，檢測本法靈敏度。

1.2.8 臨床標本檢測，共檢測30例HBV DNA血清標本。

2 結果

2.1 第一次PCR產物電泳結果 見圖1。

圖1 PCR產物電泳結果設計產物長403bp，電泳結果與預期一致。

2.2 野生型質粒去載體后序列如下

TCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCA TACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTG GGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTTGGCTTT GTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT CTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCAC CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCT ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGG TGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCATAT AAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACT CTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTC TATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGC TCTGCACCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGA ACAGTGTTCACCTCACCATACCGCACTCAG GCAA

序列中粗體字G為野生株1896位點。

2.3 變異型質粒去載體后序列如下

TCAGCAATGTCACCGACCGACCTTGAGGCA TACTTCAAAGTTTGTGTGTTTAAGGACTG GGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTTGTCTTT GTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT CTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCAC CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCT ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGG TGGCTTTAGGGCATGGACATCGACCCATAT AAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACT CTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTC TATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGC TCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGA ACATTGTTCACCTCACCATACCGCACTCAG GCAA

序列中粗體字A為變異株1896位點。

2.4 野生型標準品擴增曲線 見圖2。

圖2 野生型標準品擴增曲線

2.5 變異型標準品擴增曲線 見圖3。

圖3 變異型標準品擴增曲線

2.6 臨床標本檢測 本法靈敏度為1×103IU／ml，本次實驗共檢測30個標本，HBV DNA含量大于1×103IU／ml為陽性，有7個標本只檢測到野生株，4個標本只檢測到變異株，其余19個標本都是變異株與野生株混合感染。

3 討論

HBV是不完全雙鏈環狀DNA病毒，HBV復制過程中要經過逆轉錄，由于逆轉錄酶缺乏有效的堿基校對功能，故HBV基因組比一般DNA病毒易發生變異，這給疾病的預防、診斷、治療和預后帶來新問題［3－4］。前C區是HBV基因組的高變區，前C區最常見的變異為G1896A，導致HBeAg陰轉，影響干擾素對HBV的療效。

由于干擾素對乙型肝炎病毒患者抗病毒治療療程長、存在不良反應、患者花費大，因而治療前需對患者進行評估。HBeAg陰性患者，可用中藥方劑抗病毒治療［5］。干擾素治療對象主要是HBeAg陽性患者。在HBV感染者體內，常形成以一個優勢株為主的相關突變株病毒群，稱為準種［6］（quasispecies），即變異株與野生株的混合感染。在HBeAg陽性患者體內有些是G1896A點突變株和G1896野生株的混合感染，干擾素對G1896野生株有較好的療效，而對G1896A點突變株療效不好，對這類患者用干擾素治療體內會出現G1896A點突變株成為優勢感染株，達不到抗病毒治療的效果。如果單純是G1896野生株感染，可直接用干擾素治療。

本法是結合3′－堿基特異性引物的熒光定量PCR法，與特異性探針雜交法、PCR－RFLP（PCR限制性片斷長度多態性分析）法、測序法等法相比具有簡單快速，且能同時檢測前C區1896位點變異株與野生株混合感染，有推廣應用價值。

［1］Bayraktar Y，Koseoglu A，Temizer A，et al.Relationship between the serum alamine aminotransferase level at the end of interferon treatment and histolotic Changes in wild type and precore mutant hepatitis B virus infections［J］.J Viral Hepat，1996，3：137.

［2］郭龍華，董長垣，高 婧，等.一種從血清標本中快速提取HBV DNA方法的建立［J］.武漢大學學報（醫學版），2005，26：344.

［3］Madden CR，Fingeold MJ，Slagle BL.Altered DNA mutation spectrum in aflatoxin bl－treated transgenic mice that express the hepatitis B virus X protein［J］.J Virol，2002，76：1170.

［4］Charlotte LCW，Peter M，Anna LB，et al.Evaluation of a line probe assay for identification of hepatitis B virus precore Variants in serum form chronic hepatitis B carriers［J］.J Virol Methods，2008，114：97.

［5］楊宏志，王擁澤，戴 敏，等.扶正祛邪和清熱解毒方藥治療乙型肝炎病毒前C區基因變異的臨床對照研究［J］.中華實用中西醫雜志，2003，16（13）：74.

［6］高鳳萍，左 峰.乙型肝炎病毒準種的研究進展［J］.口岸衛生控制，2010，15（13）：52.