聯(lián)合應(yīng)用siRNA抑制HBVcccDNA的實(shí)驗(yàn)研究

李靜紅，武立剛，周亞丹，崔 穎，李桂秋

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬三院，黑龍江 齊齊哈爾161000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 微生物科）

RNA干擾是細(xì)胞利用21－23nt雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后同源m RNA沉默的現(xiàn)象［1］。由于具有高度特異性和有效性，RNA干擾被廣泛用于HIV、HCV、流感病毒等功能性基因的研究中?；谀孓D(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)在HBV復(fù)制中的重要作用，一些學(xué)者已經(jīng)證實(shí)RNA干擾可以通過(guò)沉默病毒基因來(lái)抑制HBV復(fù)制［2，3］，這為抗 HBV 慢性感染提供了一種新的方法。我們?cè)?jīng)報(bào)道過(guò)針對(duì)HBV核定位信號(hào)區(qū)的小干擾RNA（siRNA）能夠有效抑制 HBV DNA復(fù)制和ccc DNA擴(kuò)增［4］。因?yàn)?HBV感染是多基因參與的細(xì)胞內(nèi)感染過(guò)程，我們認(rèn)為聯(lián)合使用siRNA能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抗HBV作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)贖ep G2.2.15細(xì)胞中聯(lián)合應(yīng)用siRNA來(lái)抑制HBV復(fù)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用siRNA比單獨(dú)應(yīng)用siRNA產(chǎn)生更強(qiáng)烈的抑制HBV復(fù)制作用，特別是對(duì)cccDNA的抑制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 （DMEM）和G418購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。Hep G2.2.15細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒psi／U6由武漢晶賽公司提供。PCR引物由上海博雅 生物公司合成。Trizol，M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，Lipofection 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。所用限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體 我們?cè)谫|(zhì)粒psil／U6的Bam HⅠ－HindⅢ位點(diǎn)之間插入一段21nt的編碼相應(yīng)siRNA的特異序列構(gòu)建了HBVsiRNA的表達(dá)載體，并進(jìn)一步通過(guò)BLAST分析為未發(fā)現(xiàn)同源序列。引物序列如下：siRNA1：5’－AAGATCTCAATCTCGGGAATC－3’；siRNA2：5’－CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC－3’；無(wú)關(guān)對(duì)照質(zhì)粒HK：5’－ACTACCGTTGTTATAGGTG－3’。重組質(zhì)粒通過(guò)酶切和DNA序列分析加以鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Hep G2 2.2.15細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含青霉素100 U／ml，鏈霉素100μg／ml，200μg／ml G418），37℃ ，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將細(xì)胞置于6孔板培養(yǎng)，4μg表達(dá)相應(yīng)siRNA的質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按說(shuō)明書步驟共轉(zhuǎn)染，每24小時(shí)更換培養(yǎng)液，分別于48、72、96小時(shí)收集細(xì)胞做進(jìn)一步分析，實(shí)驗(yàn)分為5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 檢測(cè) 用ELISA方法測(cè)定48、72、96小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBs Ag and HBeAg的表達(dá)，按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 HBV mRNA的檢測(cè) 分別于48、72、96小時(shí)用Trizol法從細(xì)胞中提取RNA，用M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)如下：先在94℃變性3 min，然后按下述條件循環(huán)30次，變性94℃15 s、退火52℃30 s、延伸72℃30 s，最后72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。PCR引物如下：HBV上鏈引物：5’－ACCTCTGCCTAATCATCTC－3’下鏈引物：5’－GTAAGACAGGAAATGTGAAAC－3’；β－actin 上鏈 引 物 5′－GTCGGTGTGAACGGATTT－3′GAPDH下鏈引物5′－ACTCCACGACGTACTCAGC－3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳分析。

1.6 HBV DNA和cccDNA的檢測(cè) 分別于48、72、96小時(shí)從培養(yǎng)上清和細(xì)胞中提取HBVDNA和cccDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件，統(tǒng)計(jì)處理以每組3個(gè)復(fù)孔測(cè)定值的表示，組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg和HBeAg的抑制作用 用ELISA方法測(cè)定48、72、96小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBe Ag和HBs Ag的表達(dá)，HBe Ag和HBs Ag的濃度。如圖1所示，在各個(gè)時(shí)段，無(wú)關(guān)對(duì)照組對(duì) HBs Ag和HBe Ag的表達(dá)與空載體組相比無(wú)明顯差異（P＜0.05），說(shuō)明RNAi作用是特異的。在各個(gè)siRNA治療組，HBs Ag和HBe Ag水平均有明顯下降，轉(zhuǎn)染96小時(shí)后聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)HBs Ag和HBe Ag的抑制率最強(qiáng)（83.89% ，91.07%）與單獨(dú)應(yīng)用siRNA組相比均具有明顯差異（P＜0.05）。

2.2 Hep G2 2.2.15細(xì)胞中 HBV mRNA的抑制作用 HBVmRNA水平用RT－PCR來(lái)檢測(cè)，結(jié)果顯示各個(gè)siRNA治療組均能明顯降低mRNA水平，空載體組對(duì)mRNA無(wú)抑制作用。在96小時(shí)聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)mRNA的抑制率最強(qiáng)，幾乎檢測(cè)不到mRNA條帶，抑制效果明顯高于單獨(dú)應(yīng)用組（圖2）。

圖1 siRNA對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)水平的抑制

2.3 HBV DNA的抑制作用 HBV DNA和cccDNA水平用實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢測(cè)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到104－108拷貝。如圖3所示，各個(gè)siRNA治療組均能明顯降低DNA水平，空載體組對(duì)DNA無(wú)抑制作用。在96小時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用siRNA組病毒DNA拷貝數(shù)與對(duì)照組相比減少88.6%，抑制作用明顯高于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，各個(gè)siRNA治療組cccDNA水平分別下降50.4%（siRNA1），22.31%（siRNA2），69.83%（siRNA1＋2）。可見，聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)cccDNA的抑制作用明最強(qiáng)，明顯高于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組（P＜0.05）。

圖3 siRNA對(duì)HBV DNA和cccDNA水平抑制

3 討論

RNA干擾技術(shù)為治療HBV感染提供了新的有效方法。據(jù)報(bào)道，單獨(dú)應(yīng)用合成的siRNA治療HBV、HCV、HIV時(shí)，會(huì)引起病毒突變。為了解決這一問(wèn)題，用針對(duì)病毒基因組的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)siRNA和選擇相對(duì)保守的區(qū)域。聯(lián)合療法可最大限度的降低病毒載量，成為治療HBV感染的新方法［5，6］。我們?cè)?Hep G2 2.2.15細(xì)胞中檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用siRNA的抗病毒效果，并與單獨(dú)應(yīng)用siRNA進(jìn)行了比較。因?yàn)镠BV感染是多基因參與的細(xì)胞內(nèi)感染過(guò)程，聯(lián)合使用siRNA能夠同時(shí)阻斷病毒基因的多個(gè)位點(diǎn)，使病毒難以修復(fù)，發(fā)揮更強(qiáng)的抗HBV作用。

Hep G2.2.15細(xì)胞是由頭尾相接的 HBV－DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株 Hep G2細(xì)胞而建立的，該細(xì)胞株能長(zhǎng)期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清液中分泌病毒蛋白和完整的病毒顆粒，還能產(chǎn)生大量的病毒復(fù)制中間體，更接近于HBV自然感染狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)HBV核定位信號(hào)區(qū)的特異性siRNA被轉(zhuǎn)染入Hep G2.2.15細(xì)胞中，并對(duì)各種指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，HBs Ag、HBeAg、mRNA水平都受到抑制；同時(shí)，real－time PCR結(jié)果顯示，DNA和cccDNA水平也明顯下降，這種抑制作用具有高度選擇性、特異性、劑量依賴性的特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用的各siRNA治療組均能明顯抑制HBV復(fù)制，其中聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)HBV的抑制作用最強(qiáng)，抑制效果明顯高于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組。

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