以組織因子為靶點的腫瘤免疫治療結合物的合成及其對結直腸癌細胞的影響

許 希, 饒本強, 梁綺雯 劉 丹, 譚 獲, 汪建平△, 黃振倩△

(1廣州醫學院第一附屬醫院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510230；2中山大學附屬第六醫院，廣東 廣州 510655)

1000-4718(2012)03-0420-07

2011-07-31

2011-12-21

△通訊作者 汪建平 Tel:020-38250737; E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn; 黃振倩 Tel:020-34294310;E-mail:huangzq2003@yahoo.com.cn

▲并列第1作者

以組織因子為靶點的腫瘤免疫治療結合物的合成及其對結直腸癌細胞的影響

許 希1▲, 饒本強2▲, 梁綺雯2劉 丹1, 譚 獲1, 汪建平2△, 黃振倩1△

(1廣州醫學院第一附屬醫院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510230；2中山大學附屬第六醫院，廣東 廣州 510655)

目的構建含hFVII-LC+hIgG1-Fc cDNA的重組真核表達載體，并轉染中國倉鼠卵巢細胞亞株CHO-K1獲得以組織因子(TF)為靶點的免疫治療結合物用于腫瘤的靶向治療。方法用分子生物學方法從漢族人肝組織和淋巴細胞中分別獲得hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段并用連接酶正向克隆入真核表達質粒pcDNA3.1(+)中。以脂質體法轉染陽性質粒入CHO-K1細胞，G418加壓篩選獲得陽性單克隆細胞；Excel 301無血清培養液擴大培養， 培養液Ni-NTA親和層析純化和制備hFVIII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白，ELISA法檢測該融合蛋白與TF的靶向作用，免疫激活物與結腸癌細胞HT-29及NK細胞混合培養檢測結合物激活NK細胞的能力。結果以漢族人肝組織和淋巴細胞為模板擴增的hFVII-LC和hIgG1-Fc DNA片段經測序證實與基因庫報道的系列完全一致；經酶切分析、測序證實構建的hFVII-LC+hIgG1-Fc融合基因片段完整地落在真核表達質粒pcDNA3.1(+)的閱讀框架中；LipofectamineTM2000轉染試劑能獲得含pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc陽性的CHO-K1細胞，經1 g/L G418加壓篩選可以獲得分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的單克隆細胞株；1L Excel 301無血清培養液用Ni-NTA親和層析純化可以制備1.3 mg hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白，經ELISA法鑒定與TF具有高親和力，免疫激活物與結腸癌細胞HT-29及NK細胞混合培養表現出明顯的激活NK細胞的能力。結論成功構建了hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的真核表達載體并獲得了分泌hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白的CHO-K1單克隆細胞株，為制備以TF為靶點的腫瘤免疫治療結合物奠定了基礎。

腫瘤靶向治療; 組織因子; 免疫結合物; CHO-K1細胞

組織因子(tissue factor，TF)，是一個由263個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，分子量約為47 kD。生理狀態下組織因子位于血管壁外膜細胞，包繞血管的成纖維細胞、巨噬細胞、部分上皮細胞中，而在血管內皮細胞中無表達。臨床上發現多種腫瘤有不同程度的TF過度表達，通過不同檢測方法都證實在多種實體腫瘤細胞[1-2]、血液惡性腫瘤細胞[3]、腫瘤血管內皮細胞表面的表達均異常增高而正常組織、細胞和血管不表達，基于此，很多腫瘤學家認為TF是抗血管治療的理想靶點。凝血因子VII(factor VII，FVII)是TF的天然配體，它們之間具有很高的親和力，Hu等[4-5]利用此特性設計的免疫結合物(immunoconjugate, Icon)，由2段FVII肽段和免疫球蛋白G1可結晶片段(immunoglobulin G1 fragment crystallizable，IgG1-Fc)構成，其中FVII肽段與靶細胞的相應配體TF結合，通過IgG1-Fc可與自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells)和補體C1q結合而激活NK細胞和補體級聯反應而殺傷靶細胞，在腫瘤治療上表現出顯著的抗血管效應，因而被認為是一種較有開發前景的以TF為靶點的免疫治療結合物。但Icon 是以完整的FVII分子作為TF的靶向，容易激發凝血系統的異常甚至誘發DIC。本研究中采用中國漢族人FVII輕鏈(light chain of human factor VII，hFVII-LC)和IgG1-Fc(hIgG1-Fc)構建新的以TF為靶點的真核表達載體并制備和純化免疫結合物蛋白。

材 料 和 方 法

1試劑與細胞株

1.1材料 外周血10 mL(健康志愿者抽取)、正常肝組織(肝結石患者手術切取)、真核表達載體pcDNA3.1(+)質粒(Invitrogen)、DH5α菌株(TaKaRa)、CHO-K1(中國倉鼠卵巢細胞亞株，中國科學院細胞庫)、HT-29細胞株、轉染了CD16的NK92MI細胞(耶魯大學胡志偉教授惠贈)。

1.2試劑 人淋巴細胞分離液和RNA提取試劑盒(Promega);PrtoScriptTMM-MuLV Taq RT-PCR Kit試劑盒(Biolabs);DNA膠回收試劑盒，BamH I、EcoR I和XhoI 內切酶,T4 DNA連接酶(NEB);LipofectamineTM2000(Invitrogen);Ni-NTA樹脂和抗His標簽蛋白(Novagen);抗TF抗體(R&D);Calcein-AM (Invitrogen)。

2方法

2.1引物設計與目的基因的擴增

2.1.1根據hFVII-LC cDNA、hIgG1-Fc cDNA序列及pcDNA3.1(+)質粒圖譜，設計2對引物。引物由Invitrogen合成，hFVII-LC基因片段上游引物5′ -CGCGGATCCGCCACCATGGCCAACG CGTTCCTGGAGGAGCTG- 3′,下游引物5′- CCGGAATTCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCATTTCT- 3′。hIgG1-Fc基因片段上游引物5′ -CCGGAATTCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT- 3′,下游引物5′-CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTG-GTGTTTACCCGGAGACAGGGAGAG- 3′，在下游引物C端設計6×His標簽蛋白。

2.1.2肝組織置于RNA保存液中，并于-80 ℃中保存。

2.1.3外周血B淋巴細胞培養 用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清和10%雙抗的RPMI-1640并加入植物血凝素(0.1%，Sigma)10 μL，IL-2 1 000 U的完全培養基，于5%CO2、37 ℃恒溫箱內培養4～6 d。

2.1.4采用RNA提取試劑盒(Promega)分別提取肝組織和淋巴細胞總RNA。操作方法按說明書進行。紫外分光光度計測定RNA含量與純度。PrtoScriptTMM-MuLV Taq RT-PCR Kit試劑盒逆轉錄合成互補DNA第1鏈，反應條件：1 μg肝組織總RNA、50 μmol/L dT23VN 2 μL和dNTP Mix 2 μL混勻，DEPC水調整至總體積16 μL，70 ℃水浴5 min后加入10×RT buffer 2 μL、RNase inhibitor 1 μL和M-MuLV逆轉錄酶1 μL，42 ℃水浴1 h，90 ℃水浴5 min滅活逆轉錄酶，DEPC水調整產物濃度至總體積50 μL。PCR反應體系：Taq2×Master Mix 25 μL，上游引物 10 μmol/L 1 μL,下游引物10 μmol/L 1 μL，cDNA產物5 μL，DEPC水18 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共35個循環；72 ℃ 8 min終止反應。hFVII-LC PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用同樣的方法對淋巴細胞總RNA進行RT-PCR反應，獲得hIgG1-Fc基因PCR產物。

2.2pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc重組真核表達載體的構建及鑒定 用BamH I和EcoR I分別雙酶切hFVII-LC PCR擴增產物和pcDNA3.1(+)質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，于37 ℃在T4 DNA連接酶作用下連接1 h，然后轉化DH5α感受態細胞，篩選Amp抗性克隆，用PCR、雙酶切及測序方法鑒定陽性克隆pcDNA3.1(+)-hFVII-LC，用同樣的方法及EcoR I、XhoI內切酶構建pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc 最后酶切及測序方法鑒定陽性克隆。重組表達載體構建流程見圖1。

Figure 1. The construction of a recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc.

圖1質粒構建流程圖

2.3細胞轉染和陽性克隆篩選 參照LipofectamineTM2000(Invitrogen)說明書，將pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc和pcDNA3.1(+)質粒轉染中國倉鼠卵巢細胞亞株CHO-K1中，48 h后將轉染細胞按1∶10傳代，繼續培養24 h，換含G418(Invitrogen) 1 g/L的F12培養基篩選2周。挑取單細胞陽性克隆繼續在含G418 500 mg/L的培養基中擴大培養。轉染后兩種細胞分別命名為CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc和CHO-K1空細胞。

2.4用半定量RT-PCR鑒定轉染是否成功 收獲對數生長期的CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc和CHO-K1細胞，采用RNA提取試劑盒分別抽提2種細胞總RNA(Promega)。用M-MuLV逆轉錄酶制備cDNA，取cDNA進行PCR擴增。hFVII-LC基因片段引物同上，hFVII-LC+hIgG1-Fc重組基因片段上游引物5′-CGCGGATCCGCCACCATGGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTG- 3′,下游引物5′ -CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTT-ACCCGGAGACAGGGAGAG- 3′。GAPDH(內參照)上游引物5′ -TGCATCCTGCACCAACT- 3′,下游引物5′ -CGCCTGCTTCACCACCTTC- 3′。擴增條件為：95 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共35個循環；72 ℃ 8 min。

2.5生成、純化和鑒定hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白

2.5.1G418篩選出的CHO-K1單細胞克隆轉入175 cm2細胞培養瓶中用含10%胎牛血清和500 mg/L G418的F12培養基培養至細胞融合度達90%時，棄培養基，用PBS洗3次然后換入不含胎牛血清CHO-K1 Excel 301(JRH Biosciences)培養基并添加維生素K1使終濃度達1 mg/L。無血清細胞培養基每個星期收集2次。收集的培養基于-20 ℃中凍存。

2.5.2hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白使用Ni-NTA樹脂(Novagen)純化，并使用離心過濾管(MWCO 10 000 Milipore)濃縮蛋白。通過親和層析純化的hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白經過SDS-PAGE蛋白膠檢測其純度及分子量大小。提純的蛋白于-20 ℃保存。

2.5.3純化后蛋白，BCA法測蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸5 min，取20 μL上樣進行SDS-PAGE電泳；電泳后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉；隨后加入鼠抗人His抗體(Novagen)，4 ℃孵育過夜；加辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗，作用1 h，用TBST洗3次，每次10 min，然后用ECL顯色液顯色，并進行曝光顯影。

2.6hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白與TF親和力檢測 以1.25 mg/L TF包被酶標板(100 μL/well)，4℃濕盒包被過夜，第2 d 200 μL/well PBSM(PBS + 2%脫脂奶粉)37 ℃靜置封閉1 h，0.05%PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗3次。加入0、0.01、0.1、1和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc，及抗TF抗體(R&D)1 mg/L，各100 μL，30 r/min結合1 h。0.05%PBST洗3次，于各樣品孔和陰性對照孔中加入鼠抗人IgG1-Fc-HRP(Vector) 100 μL 0.4 mg/L， 30 r/min結合1 h。0.05%PBST洗3次，50 μL/well TMB避光顯色20 min，50 μL/well 2 mol/L H2SO4終止，450 nm/630 nm讀A值。

2.7hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白激活NK細胞對HT-29細胞的影響 Calcein-AM的乙酸甲基脂親酯性很高，使其可以透過細胞膜，calcein-AM本身并無熒光，但在進入細胞后被酯酶水解成綠色熒光素calcein并滯留于細胞膜完整的細胞內。如細胞膜損傷的細胞，如在ADCC(antibody-dependent cell cytotoxicity)時，calcein釋出而被檢測[6]。 HT-29細胞96孔板體外完全培養基培養，當細胞濃度生長至1×104時用于實驗。方法如下：預溫的不含鈣1×HBSS洗細胞1次，加50 μL 8 μmol/L calcein-AM ，37 ℃孵育40 min。 不含鈣HBSS液洗細胞1次，加入0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白(含鈣的HBSS 含5 mmol/L CaCl2稀釋)，加入轉染了CD16的NK細胞(人源性鈕扣細胞，由耶魯大學癌癥中心胡志偉教授惠贈)作為效應細胞至總體積200 μL HBSS液， 37 ℃ 孵育4 h。另設一空白孔不加NK細胞及提純蛋白，余步驟同前，并于該孔加裂解液20 μL (9% Triton X-100溶解于雙蒸水) 裂解細胞，孵育45 min。離心后每孔取上清100 μL 至新的96孔板作熒光分光光度計檢測，熒光的激發和發射波長分別為490和515 nm。ADCC效應評價公式：hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白組熒光值/空白孔熒光值(最大熒光標記值)×100%。

3統計學處理

結 果

1pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc真核表達載體的構建

使用特異引物進行RT-PCR，從肝組織和淋巴細胞中擴增得到目的基因片段，將其插入pcDNA3.1(+)真核表達載體，構建成pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc重組載體。經BamH I、EcoR I和XhoI三酶切，可見約5.4 kb、696 bp和456 bp大小的3條帶，分別為酶切后的載體片段及2條目的片段，見圖2。將pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc陽性重組子進行DNA測序，測序結果與GenBank中的hFVII-LC和hIgG1-Fc序列完全吻合，且帶有編碼6×His標簽蛋白序列,見圖3。說明pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc真核表達載體構建成功。

Figure 2. Enzyme digestion identification of the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc. M:100～6 000 bp marker; 1: hFVII-LC ; 2: hIgG1-Fc ; 3:pcDNA3.1(+)- hFVII-LC+hIgG1-Fc plasmid without digestion; 4～5: pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc plasmid digested byBamH I,EcoR I andXhoI.

圖2重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc的酶切鑒定

Figure 3. Partial Chromas figure of recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc.

圖3質粒測序圖

2RT-PCR檢測hFVII-LC+hIgG1-FcmRNA的表達

對CHO-K1-hFVII-LC+hIgG1-Fc細胞的總RNA進行RT-PCR擴增，結果擴增出大小為456 bp的hFVII-LC條帶、大小為1 152 bp的hFVII-LC+hIgG1-Fc條帶以及大小為327 bp的GAPDH條帶，見圖4。在相同RT-PCR擴增條件及加樣量下，同步轉染空質粒CHO-K1細胞無特異目的條帶。

3SDS-PAGE凝膠檢測通過Ni-NTA樹脂純化后蛋白的純度和分子量大小

收集的無血清培養基經過Ni-NTA樹脂純化后得到較純的目的蛋白分子量大小為55～70 kD之間。經Western blotting檢測純化后的蛋白帶有His標簽蛋白，見圖5。

4ELISA檢測hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與TF的親和力

檢測5個不同稀釋度(0、0.01、0.1、1和10 mg/L)的hFVII-LC+hIgG1-Fc與TF的結合能力，在450 nm/630 nm雙波長下分別測定其A值，各平行對照孔的平均值分別為0.091、0.283、0.385、0.464和0.765。A值越大說明合成的免疫結合物與TF的結合能力越強，故以上結果提示免疫結合物與TF有親和力，且呈劑量依賴性，見圖6。

5hFVII-LC+hIgG1-Fc融合蛋白激活NK細胞對HT-29細胞的影響

加0 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白組細胞ADCC效應比例為9.60%±0.25%，1 mg/L和10 mg/L hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白對人結直腸癌的ADCC效應分別為47.20%±0.81%和69.60%±0.42%,ADCC效應在1 mg/L組、10 mg/L組與0 mg/L組比較均有顯著差異(P<0.05),在0～10 mg/L范圍內呈劑量依賴關系，見圖7。

Figure 4. The RT-PCR for hFVII-LC+hIgG1-Fc. M：100～6 000 bp ladder marker; 1: hFVII-LC; 2: hFVII+hIgG1-Fc; 3:GAPDH; 4:negative control.

圖4RT-PCR檢測轉染后CHO-K1細胞hFVII-LC+hIgG1-FcmRNA的表達

Figure 5. Protein purification and detection. A:Ni-NTA affinity chromatography. M:protein markers,10～170 kD; 1:collected serum-free medium; 2:flow-through; 3:eluate(target protein).B:His-tag Western blotting.

圖5蛋白純化和檢測

Figure 6. The immunoconjugate identified by ELISA on tissue factor (TF) affinity and specificity.

圖6ELISA檢測hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與TF的親和力

討 論

越來越多的研究顯示TF在多種腫瘤細胞上的特異性表達與腫瘤的發生、發展有著密切的聯系，其誘導的凝血級聯反應及與之相關的信號途徑等機制與促進腫瘤血管形成、腫瘤轉移和腫瘤生長有關[7]，更有學者提出組織因子與腫瘤干細胞是否存在聯系[8-9]，即TF有可能是腫瘤干細胞表面標志物。許多針對TF在腫瘤細胞上特異性表達的靶向治療如siRNA干擾腫瘤細胞TF的表達[10],或者使用組織因子特異性抗體如重組線蟲抗凝蛋白c2(rNAPc2)[11]和Versteeg等[12]阻斷組織因子的信號轉導途徑等在動物實驗中都表現出腫瘤抑制作用。以TF為靶點的腫瘤靶向治療免疫交聯物hFVII-LC+hIgG1-Fc不僅可以破壞癌細胞，亦可以針對腫瘤所依賴的供應血管從而防止腫瘤的進一步生長。Hu等[4-5]設計的抗體類似物，由編碼點突變(K341A)hFVII和IgG1-Fc構成的Icon在應用于包括黑色素瘤、前列腺癌和乳腺癌等動物模型上時表現出顯著效果，使移植瘤消退，但是，動物實驗表現出該結合物對小鼠的凝血功能有一定影響。FVII屬于絲氨酸蛋白激酶家族成員，晶體結構分析發現，FVII由輕鏈和重鏈組成，輕鏈中EGF和Gla區都與其與TF緊密結合有關，而重鏈則與凝血反應有關[13]。作為靶向治療，靶向片段的靶向性與其分子量大小和穩定性有重要聯系，利用TF的天然配基FVII中與TF緊密結合且不引起凝血功能異常的片段FVII-LC構成的靶向治療免疫結合物，能達到靶向治療的目的且減少引起凝血功能異常的危險。并且有研究發現中國漢族人的IgG-Fc基因與基因庫比較存在2個基因堿基的差異，且CH3區編碼的氨基酸不同[14]。我們之前設計的hFVII-LC+hIgG1-Fc腺病毒載體，治療結直腸癌小鼠模型體內產生的hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白表現出與TF的親和力與hFVII一樣，且遠高于TF的單克隆抗體。因而我們合成的新hFVII-LC+hIgG1-Fc免疫交聯物有如下特點：(1)為研究不引起機體凝血異常的以TF為靶點的腫瘤治療免疫結合物提供基礎。(2)hFVII-LC解決了點突變FVII分子量太大不適合于基因干預治療的問題。(3)使用提純蛋白作為藥物可減少以腺病毒為載體在動物實驗中表現出來的肝損傷。(4)對研究 IgG效應片段基因差異是否會影響IgG對疾病的免疫反應性提供對比物。通過引物設計加入6×His標簽蛋白，利于蛋白的純化和檢測，因6×His很小，在生理pH值下較穩定，因此不改變重組蛋白的折疊結構和生化特性，對蛋白功能幾乎沒有影響值。(5)hFVII-LC+hIgG1-Fc免疫交聯物在體外實驗中，對結直腸癌細胞HT-29細胞株ADCC效應與對照組相比表現出顯著差異性,且ADCC效應在0～10 mg/L范圍內呈劑量依賴關系。

圖7hFVII-LC+hIgG1-Fc蛋白與NK細胞混合培養對HT-29細胞的殺傷作用

本研究成功構建了免疫交聯蛋白hFVII+hIgG1-Fc的真核表達載體，并獲得相關蛋白，今后我們將驗證其體外與體內的腫瘤治療效果。

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Constructionofanimmunoconjugatetargetingtissuefactoranditseffectoncolorectalcancercells

XU Xi1, RAO Ben-qiang2, LIANG Qi-wen2, LIU Dan1, TAN Huo1, WANG Jian-ping2, HUANG Zhen-qian1

(1TumorBloodCenter,FirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510230,China;2TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:huangzq2003@yahoo.com.cn)

AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc, and to produce and purify the immunoconjugate hFVII-LC+hIgG1-Fc protein.METHODSThe target sequences were amplified by RT-PCR from hepatic tissue and lymphocyte RNA, and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transfected into CHO-K1 cells by lipofectamine 2000. The transfectant clones were selected by G418 screening. The positive monoclonals were grown in CHO-K1 serum-free medium Excel 301 and the culture medium was collected. The hFVII-LC+hIgG1-Fc protein was purified by affinity Ni-NTA resin. The immunoconjugate was identified by ELISA with tissue factor (TF) affinity and specificity. Induction of NK cell-mediated antibody-dependent cell cytotoxicity(ADCC) was examined in HT-29 colorectal cancer cell line.RESULTSHuman liver tissue and lymphocytes from Han population were used as template for amplification of hFVII-LC and hIgG1-Fc DNA fragments, which were confirmed by sequencing and were exactly the same as those GenBank reported. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-hFVII-LC+hIgG1-Fc was successfully constructed, and 1.3 mg of hFVII-LC+hIgG1-Fc protein could be prepared from 1 liter of Excel 301 serum-free culture medium through Ni-NTA affinity chromatography. The immunoconjugate was specially bound to TF and induced a significant ADCC response in HT-29 cells.CONCLUSIONThe human hFVII-LC+hIgG1-Fc recombinant plasmid and the hFVII-LC+hIgG1-Fc immunoconjugate are obtained, which provide the basis for further study of cancer-targeted therapy.

Tumor targeted therapy; Tissue factor; Immunoconjugate； CHO-K1 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.007