附子多糖保護缺氧/復氧乳鼠心肌細胞及其抗內質網應激的機制研究*

劉 穎， 紀 超， 吳偉康

(1廣東藥學院基礎學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510006； 2中山大學中西醫結合研究所，廣東 廣州 510089)

1000-4718(2012)03-0459-05

2011-10-12

2011-12-05

廣東省科技計劃項目(No.2008B060600055)

△通訊作者Tel:020-39352121； E-mail:13322819916@163.com

附子多糖保護缺氧/復氧乳鼠心肌細胞及其抗內質網應激的機制研究*

劉 穎1△， 紀 超1， 吳偉康2

(1廣東藥學院基礎學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510006；2中山大學中西醫結合研究所，廣東 廣州 510089)

目的觀察附子多糖對缺氧/復氧后心肌細胞的保護，并探討附子多糖的保護機制是否與其抑制內質網應激反應有關。方法建立乳鼠心肌細胞缺氧/復氧模型，將乳鼠心肌細胞分為正常對照組、缺氧/復氧組(缺氧3 h后復氧6 h)和不同濃度附子多糖(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)+缺氧/復氧組。MTT法測定心肌細胞存活率，流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率，Western blotting分析葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表達，熒光定量PCR進一步檢測CHOP及caspase-12 mRNA表達。結果缺氧復氧后，心肌細胞中內質網應激反應標志蛋白GRP78表達增加，內質網應激凋亡相關蛋白CHOP及caspase-12蛋白和mRNA表達亦明顯升高。與缺氧/復氧組相比較，附子多糖預處理24 h后可以有效抑制缺氧/復氧引起的GRP78、 CHOP和caspase-12的表達上調，增加心肌細胞的存活率，抑制心肌細胞凋亡的發生。附子多糖的保護效應呈劑量依賴形式，10 g/L劑量時達到峰值。結論附子多糖保護缺氧/復氧后心肌細胞的可能機制與其抑制內質網應激所介導的細胞凋亡途徑相關。

附子多糖； 內質網應激； 缺氧/復氧損傷; 心肌細胞

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理過程，其發生機制復雜，涉及多方面因素[1]。近年來研究證實，心肌缺血再灌注過程中引發的氧化應激、鈣超載、ATP耗竭等將誘發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，過度ERS介導的心肌細胞功能的障礙及心肌細胞凋亡進一步參與了缺血再灌注損傷的發生[2]。附子多糖(Fuzi polysaccharide，FPS)是從中藥附子中提取分離的多糖成分，新近研究提示，附子多糖具有良好的抗心肌氧化應激損傷的作用[3]。但附子多糖能否對抗內質網應激發揮對心肌的保護，尚未見報道。由于缺氧和缺血有著極其相似的病理改變和發病機制，本實驗以缺氧/復氧乳鼠心肌細胞模型模擬在體心肌缺血再灌注損傷，觀察FPS對缺氧/復氧心肌細胞的保護，和對內質網應激標志蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、內質網相關促凋亡蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)和cas-pase-12表達的影響，探討附子多糖能否通過抑制ERS來保護心肌細胞，對抗缺氧/復氧引起的損傷，從而為深入闡明附子多糖的藥理作用提供新的實驗資料。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物 鑒定合格的附子多糖由中山大學中西醫結合研究所提供[4]，分子量14 kD，純度大于99.8%。使用時溶于細胞培養液中配成實驗所需濃度。

1.2動物 出生48 h內的SD乳鼠(購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK 粵2008-0020)。

1.3主要試劑 胰蛋白酶(BioSHARP)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，青-鏈霉素溶液(吉諾生物醫藥技術有限公司)；DMEM高糖培養基及DMEM低糖培養基(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；AnnexinⅤ-FITC試劑(Beckman Coulter)；兔抗大鼠GRP78、CHOP、caspase-12及GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物科技研究所)；WB超敏發光液(北京普利來基因有限公司)；Trizol、M-MLV逆轉錄酶和RNasin (Invitrogen)，Thunderbird SYBR?Green qPCR Mix(QPS-201)(Toyobo)。

1.4儀器 ELx800酶標儀(BioTek)；Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機(Eppendorf)；Coulter Epics XL流式細胞儀(Beckman Coulter)；MiniOpticon Real-time PCR儀(Bio-Rad)；垂直電泳儀及轉膜儀(C.B.S. Scientific)；凝膠成像系統(Vilber Lourmat)；CO2培養箱(Model TC2323)(Shel Lab)。

2方法

2.1乳鼠心肌細胞原代培養 無菌操作取出乳鼠心臟，剪碎，消化法分離心肌細胞。收集消化液后經200目篩過濾制成單細胞懸液，離心棄上清，用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸細胞，接種于培養瓶中，差速貼壁培養90 min，去除成纖維細胞。調節細胞濃度至5×108/L接種于96孔板，置于CO2培養箱培養，48 h后換含15%胎牛血清的高糖DMEM培養液，待細胞基本融合成片，選擇生長良好、搏動規律的細胞用于實驗。

2.2心肌細胞缺氧/復氧模型的建立 不含血清的DMEM低糖培養基，純氮1 L/min流量充分飽和30 min，用上述培養基置換正常培養基，將細胞放入密封袋充入高純度氮氣，密封放入培養箱培養為缺氧；用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養液置換培養基，置于95%O2+5%CO2培養箱常氧培養為復氧。

2.3實驗分組 將心肌細胞分為3組：(1)正常對照(Control)組：用含15%血清的DMEM高糖培養基常規培養9 h；(2)缺氧/復氧(H/R)組：缺氧3 h后復氧6 h；(3)附子多糖+缺氧/復氧(FPS+H/R) 組：將心肌細胞置入不同濃度的(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)附子多糖培養液中，常規培養24 h后，缺氧3 h后復氧6 h。

2.4MTT法檢測細胞活力 取對數生長期細胞接種于96孔板內，實驗結束后，每孔加入5 mg/L噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide，MTT)溶液20 μL，37 ℃培養4 h，吸去孔內液體，每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)150 μL，搖床10 min,待結晶充分溶解后，590 nm波長酶標儀檢測光吸收值。細胞存活率(%)=處理組A590/正常組A590×100%。

2.5細胞凋亡率 實驗結束后，收集細胞，用0.02%EDTA消化細胞，制備細胞懸液，用Annexin V-FITC試劑盒中binding buffer懸浮細胞，調節細胞濃度為1×109cell/L，取100 μL細胞，分別加入碘化丙啶(propidium iodide,PI) 和膜聯蛋白V(Annexin V)，避光冰浴10 min，上機檢測。

2.6GRP78、CHOP和caspase-12的Western blotting分析 收集細胞，提取細胞總蛋白, Bradford 法測蛋白濃度。取樣品蛋白質 30 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移蛋白至硝酸纖維膜，5%封閉液封閉2 h，分別加入GRP78(1∶200)、CHOP(1∶200)和caspase-12(1∶200)抗體，和上樣對照GADPH抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜。加入Ⅱ抗(1∶1 000)，37 ℃振蕩孵育1 h。 ECL顯色，放射自顯影檢測。以GAPDH作內參照，分析GRP78、CHOP和 casepase-12蛋白條帶掃描灰度變化。

2.7熒光定量PCR測定CHOP和caspase-12 mRNA的表達 提取心肌細胞總RNA。所有實驗用品均預先進行去RNA酶處理, 整個過程在冰浴中進行。采用逆轉錄酶及隨機引物進行逆轉錄反應, 嚴格按逆轉錄試劑盒說明書操作。實時熒光定量PCR引物由上海英俊公司合成。CHOP上游引物5’-TGTTGAAGATGAGCGGGTG-3’，下游引物5’-CAAGGTGAAAGGCAGGGACTC-3’；Casepase-12序列，上游引物5’-ATTCCTGGTCTTTATGTCCC-3’，下游引物5’-ATACTCTCTCAATGGTGGGC-3’；β-actin上游引物5’-CTATTGGCAACGAGCGGTT-3’，下游引物5’-GGCATAGAGGTCTTTACGGATGT-3’。采用高溫啟動法進行實時熒光定量PCR循環, 擴增的每個標準均設內參對照, 每個指標均有正常組作對照。進行PCR 循環擴增(40個循環) , 循環條件(兩步法， 退火60 ℃，延伸72 ℃)。取相對定量( relative quantity, RQ)值進行統計分析。

3統計學處理

結 果

1心肌細胞存活率

與正常對照組相比，缺氧/復氧組的細胞存活率顯著下降(P<0.01)。經FPS預處理24 h后，與缺氧/復氧組相比， FPS呈劑量依賴性增加心肌細胞的存活率，在10 g/L時基本達到飽和，20 g/L時心肌細胞存活率增幅趨緩，見表1。

表1各組心肌細胞存活率、凋亡率以及CHOPmRNA和casepase-12mRNA表達量的比較

GroupDose(g/L)Survivalrate(%)Apoptoticrate(%)CHOPmRNARQCaspase-12mRNARQControl-1004.80±0.65 11H/R-52.32±2.90**18.09±1.66**1.76±0.29**1.87±0.31**FPS+H/R2072.58±2.31△△14.26±1.98△△1.29±0.09△△1.32±0.25△△FPS+H/R1072.41±2.52△△14.17±1.11△△1.31±0.12△△1.33±0.19△△FPS+H/R168.97±2.33△△16.99±1.66△1.57±0.08△1.62±0.17△FPS+H/R0.158.62±2.14△17.92±1.451.72±0.271.86±0.33

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsH/R group.

2心肌細胞凋亡率

缺氧/復氧后，心肌細胞出現大量凋亡，與正常對照組相比有顯著差異(P<0.01)。經不同濃度的FPS預先處理后，FPS可劑量依賴地減少缺氧/復氧所造成的細胞凋亡，1 g/L時開始具有統計學意義，10 g/L時達到峰值,見表1、圖1。

Figure 1. Flow cytometry showed the changes of cell apoptosis among various groups.A:control; B:H/R; C～F:FPS (20, 10, 1 and 0.1 g/L, respectively)+H/R.

圖1流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡的變化

3GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達

Western blotting結果顯示，與正常對照組相比，缺氧/復氧后GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達均明顯增加。不同濃度的FPS預處理，1 g/L濃度以上時可以抑制GRP78、CHOP和caspase-12的表達，與缺氧復氧組對比，差異有統計學意義。在10 g/L時，對CHOP和caspase-12蛋白表達的抑制基本飽和，見圖2。

圖2各組心肌細胞GRP78、CHOP和casepase-12蛋白表達的比較

4CHOPmRNA和caspase-12mRNA表達

缺氧/復氧后CHOP mRNA及caspase-12 mRNA表達明顯增加(P<0.01)。FPS干預后，FPS組與缺氧/復氧組相比，可劑量依賴地抑制CHOP mRNA及caspase-12 mRNA表達，濃度達到1 g/L時差異具有統計學意義，10 g/L時達到峰值，見表1。

討 論

內質網是細胞內蛋白質合成折疊、鈣儲存的重要場所。當在細胞內外因素的影響下，內質網穩態遭到破壞，導致大量錯誤或者未折疊蛋白質在內質網腔中聚集，激活相應的信號通路，引發細胞內一系列的反應，稱為內質網應激[5]?，F已發現的內質網信號轉導通路包括：PERK (protein kinase R-like ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路和IRE1( inositol requiring enzyme 1)通路，轉導通路的激活與內質網分子伴侶GRP78結合了錯誤折疊及未折疊蛋白質后，與3種感應蛋白分離密切相關。因此，GRP78被視為內質網穩態的感受器，其表達上調標志ERS的發生。ERS是細胞的一種自我保護性機制，當嚴重的或長時間的內質網應激損傷了內質網的功能時，將誘導凋亡通路的激活而觸發細胞死亡[6]。ERS是繼死亡受體活化、線粒體損傷途徑后發現的一條重要的細胞凋亡途徑，CHOP基因的激活轉錄和內質網特有的caspase-12 的激活通路是內質網應激細胞凋亡通路的重要組成[7]。

新近的研究表明，內質網應激及其誘導的凋亡與心肌缺血再灌注損傷的發生發展密切相關。Xin等[6]發現，心肌缺血再灌注能夠激活GRP78和CHOP的表達。Zhang等[7]也在離體心臟模型上進一步證實了，缺血再灌注導致 ERS，促進 CHOP 的表達升高和caspase-12 裂解。而CHOP基因缺失小鼠，其再灌注后心肌梗死面積縮小伴隨細胞凋亡率的降低[8]。本實驗觀察到，心肌缺氧復氧后，心肌細胞存活率下降，凋亡率升高，伴隨GRP78、CHOP、caspase-12的表達明顯增加。分析原因為，缺氧復氧誘導心肌細胞產生ERS，強烈的ERS激活了CHOP、caspase-12，進而引起隨后的凋亡信號轉導級聯反應，導致細胞死亡。

目前，基于內質網應激及其誘導凋亡的分子機制，研發心肌缺血再灌注損傷保護的新策略成為研究的增長點。近年來，中藥多糖因為高效低毒的特點成為藥物開發的熱點。資料表明，許多中藥多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質過氧化，從而保護生物膜的作用[9]。附子多糖是從附子中提出的一種多糖化合物，具有一個半縮醛羥基，能和活性氧發生反應，直接清除自由基，對處于氧化應激狀態的細胞具有保護作用，但目前對其功能的研究報道甚少。劉古鋒等[3]證明，予附子多糖處理后，能夠明顯提高心肌組織抗氧化酶的活性，減少小鼠力竭運動所致的氧化應激損傷，提高小鼠的運動耐力。附子多糖還可以通過上調抗凋亡基因bcl-2的表達，抑制凋亡蛋白酶caspase-3的活化，實現抗凋亡的作用[10]。本實驗從細胞水平，觀察附子多糖對缺氧復氧乳鼠心肌損傷的影響。結果顯示，予以附子多糖預先處理后，附子多糖可以逆轉缺氧復氧所造成的心肌細胞存活率的下降和凋亡率的升高，同時，附子多糖抑制GRP78、CHOP、caspase-12蛋白及CHOP、caspase-12 mRNA的表達，附子多糖的保護效應呈劑量依賴性。實驗結果說明，附子多糖可以保護心肌細胞對抗缺氧復氧損傷，其作用機制與附子多糖抑制內質網應激反應，維持內質網穩態，阻礙內質網應激誘導的細胞凋亡有關。但附子多糖通過哪些通路作用于內質網，減輕內質網應激，還有待于進一步的研究。

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Fuzipolysaccharideprotectsneonatalratcardiomyocyteswithhypoxia-reoxygenationbyinhibitingendoplasmicreticulumstress

LIU Ying1, JI Chao1, WU Wei-kang2

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510224,China;2InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SunYet-senUniversity,Guangzhou510089,China.E-mail: 13322819916@163.com)

AIM: To investigate whether the protection mechanism of Fuzi polysaccharide (FPS) is related to inhibition of endoplasmic reticulum stress in cultured neonatal rat cardiomyocytes with hypoxia/reoxygenation (H/R).METHODSCultured rat myocardial cells were divided into control group, H/R group (hypoxia for 3 h and reoxygenation for 6 h) and different concentrations of FPS (0.1 g/L, 1 g/L, 10 g/L or 20 g/L) +H/R groups. The cell survival was detected by MTT assay and cell apoptosis of cardiomyocytes was measured by flow cytometry using Annexin V-FITC staining. The expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) and caspase-12 were determined by Western blotting. The mRNA expression of CHOP and caspase-12 was detected by quantitative PCR.RESULTSAfter reoxygenation, the expression of GRP78, CHOP and caspase-12 in cardiomyocytes was increased. Compared with H/R group, the expression of GRP78, CHOP and caspase-12 in FPS+H/R groups was significantly inhibited, the survival rate of cardiomyocytes was increased and the apoptosis of cardiomyocytes was inhibited. This protective effect of FPS was in a dose-dependent manner and reached its peak at 10 g/L.CONCLUSIONFuzi polysaccharide protects cardiomyocytes from H/R injury. The mechanism is related to inhibiting endoplasmic reticulum stress.

Fuzi polysaccharide; Endoplasmic reticulum stress; Hypoxia/reoxygenation injury; Cardiomyocytes

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.013