槲皮素對毒胡蘿卜素誘導的巨噬細胞內質網應激凋亡途徑的抑制作用及機制

岳 雯， 姚樹桐， 鮑 穎， 王家富， 楊娜娜， 商戰平△

(泰山醫學院1病理生理學教研室,2泰安市中心醫院心血管內科，3動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000)

1000-4718(2012)03-0518-06

2011-08-02

2012-01-05

△通訊作者 Tel:0538-6225010; E-mail: zhpshang@tsmc.edu.cn

槲皮素對毒胡蘿卜素誘導的巨噬細胞內質網應激凋亡途徑的抑制作用及機制

岳 雯1， 姚樹桐1， 鮑 穎2， 王家富1， 楊娜娜3， 商戰平1△

(泰山醫學院1病理生理學教研室,2泰安市中心醫院心血管內科，3動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000)

目的研究槲皮素(quercetin, Que)對毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)誘導的巨噬細胞RAW264.7內質網應激凋亡途徑的抑制作用及機制。方法1 μmol/L TG作用RAW264.7細胞24 h誘導內質網應激，不同濃度Que(80、120或160 μmol/L)與TG共同作用后，MTT法檢測細胞存活率，流式細胞術檢測凋亡率及[Ca2+]i，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態變化，Western blotting法檢測糖調節蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)及C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)的表達；Western blotting法檢測Que(160 μmol/L)和(或)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)抑制劑LY294002(15 nmol/L)與TG共同作用時GRP78和CHOP的表達。結果Que能夠抑制TG誘導的RAW264.7細胞內質網應激損傷，與TG組相比，細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，[Ca2+]i降低(P<0.05)，GRP78及CHOP表達減少(P<0.05)；LY294002單獨作用可抑制TG誘導的GRP78及CHOP表達上調(P<0.05)，但與Que聯合應用與二者單獨使用時抑制作用無顯著差異。結論Que可以抑制TG誘導的RAW264.7細胞內質網應激凋亡途徑，該作用可能與其抑制PI3K信號通路從而降低CHOP蛋白的表達有關。

槲皮素； 內質網應激； 巨噬細胞； 細胞凋亡； 磷脂酰肌醇3-激酶

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)斑塊破裂后導致血栓形成，引發急性冠脈綜合征，是當今人類健康的頭號殺手。巨噬細胞凋亡與斑塊的破裂密切相關，而持久劇烈的內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是誘導巨噬細胞凋亡的重要途徑之一[1]。槲皮素(quercetin, Que)是分布最廣的黃酮類化合物之一，具有抗氧化、抗突變、抗血管形成、抑制蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、抑制脂氧合酶、抑制組胺釋放和調節細胞周期等多種生物學作用[2]。但Que對巨噬細胞ERS的調控作用至今未能完全闡明。本文將以毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)作用巨噬細胞RAW264.7誘導ERS模型，通過對凋亡、[Ca2+]i及相關蛋白水平的檢測，探討Que對巨噬細胞ERS凋亡途徑的調節作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1主要材料及儀器

槲皮素、毒胡蘿卜素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)抑制劑(LY294002)購自Sigma；膜聯蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)雙染色試劑盒購自南京凱基生物有限公司；Fura-3/AM Ca2+濃度檢測試劑盒購自Biotium；乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, EGTA)購自索萊寶公司；兔抗鼠糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)Ⅰ抗購自Santa Cruz，其它試劑均為進口或國產分析純。流式細胞儀(FACS Calibur, Bio-Rad)；酶標儀(Tecan infinite F200, Tecan)；電泳儀(Bio-Rad PAC3000, Bio-Rad)；激光共聚焦顯微鏡(Radiance2100, Bio-Rad)。

2主要方法

2.1細胞培養 鼠源巨噬細胞RAW264.7細胞由本實驗室保存。細胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，在37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養。待細胞生長良好，調整密度為5×109/L接種于培養板，細胞處理前換入無血清的DMEM培養液培養24 h。

2.2MTT法檢測細胞存活率 細胞培養于96孔培養板，每組5個復孔。細胞經處理后，每孔加MTT 20 μL，4 h后終止培養，棄去培養液，每孔加DMSO 200 μL，充分混勻，置于37 ℃溫箱培養15 min，使結晶物充分溶解。酶標儀490 nm波長處測吸光度(A)值。細胞存活率%=(干預組A/對照組A)×100%。實驗重復3次。

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色法檢測細胞凋亡率。細胞經處理后棄去舊培養液，常規消化后制成單細胞懸液,4 ℃離心5 min，去上清后細胞沉淀用冷PBS洗2次，加500 μL結合緩沖液懸浮細胞，然后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，1 h內上機檢測。實驗重復3次。

2.4激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態 將細胞培養于放有無菌蓋玻片的6孔培養板中。細胞經處理后，用PBS潤洗3次，取500 μL結合緩沖液并加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻后滴加于玻片上，室溫避光孵育10 min，封片后上機檢測。實驗重復3次。

2.5流式細胞儀檢測[Ca2+]i處理后收集細胞，PBS洗3次，取細胞懸液加入2 μmol/L Fluo-3/AM，置培養箱中孵育30 min，其間輕微振蕩3次，無鈣緩沖液終止反應并調整細胞數目1×109/L，30 min內上機檢測。參數設置為激發光波長488 nm，發射波長526 nm，按公式計算[Ca2+]i=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]，Kd為Fluo-3的解離常數(400 nmol/L)，F為熒光強度，Fmin是加入EGTA(終濃度5 mmol/L)后的最小值，Fmax是加入10% Triton X-100后的最大值。實驗重復3次。

2.6Western blotting測定蛋白表達 收集細胞，加入裂解液冰浴30 min，15 000×g離心20 min，取上清BCA法蛋白定量，煮沸變性后取40 μg蛋白行SDS-PAGE并電轉印至PVDF膜，膜封閉后,與兔抗鼠GRP78、CHOP或GAPDH的多克隆抗體孵育4℃過夜，漂洗后與相應辣根過氧化物酶耦聯的Ⅱ抗孵育2 h, 抗原-抗體復合物用增強化學發光法(ECL)顯影，暗室X光膠片曝光，Image-Pro Plus軟件(Version 6.0, Media Cybernetics)分析蛋白條帶累積吸光度(integrated absorbance,IA)值，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值反映靶蛋白相對水平。實驗重復3次。

3統計學處理

結 果

1Que對TG作用RAW264.7細胞存活率的影響

結果顯示，TG組細胞存活率較對照組明顯降低(P<0.05)；而Que與TG共同作用后，細胞存活率較TG組升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性；Que(160 μmol/L)單獨作用細胞存活率較對照組無明顯改變(P>0.05)，結果提示Que可抑制TG對RAW264.7細胞活性的損傷,見表1。

表1MTT法檢測RAW264.7細胞存活率

GroupCellviabilityControl100TG30.81±1.21*TG+80μmol/LQue49.34±3.59#TG+120μmol/LQue56.83±2.98#TG+160μmol/LQue76.90±1.17#160μmol/LQue95.25±1.73

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTG group.

2Que對TG作用RAW264.7細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI對細胞行雙標記染色，正常細胞分布于流式圖的左下區，早期凋亡細胞分布于右下區，晚期凋亡或死亡細胞分布于右上區，早晚期凋亡細胞百分數總和稱為總凋亡率。結果顯示，對照組總凋亡率為(3.48±0.45)%；TG組總凋亡率為(70.91±2.02)%，較對照組明顯增加(P<0.05)；Que(80、120和160 μmol/L)與TG共同作用后，總凋亡率分別為(45.11±1.93)%、(36.02±1.42)%和(25.92±1.72)%，均較TG組減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性；Que(160 μmol/L)單獨作用后細胞凋亡率為(8.11±0.77)%，較對照組升高(P<0.05)，但與TG共同作用時存在交互作用。

激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，對照組和Que單獨作用組僅可見少數單染成綠色胞膜的細胞，未見紅染的胞核；TG組可見較多雙染細胞，即紅色胞核外圍鮮綠色胞膜，還可見僅著紅色的凋亡小體；而Que與TG共同作用后，紅染胞核基本消失，單染成綠色胞膜的細胞也隨Que濃度增加而逐漸減少。結果提示Que可抑制TG誘導的RAW264.7細胞凋亡,見圖1。

3Que對TG作用RAW264.7細胞[Ca2+]i的影響

結果顯示，TG作用后[Ca2+]i較對照組明顯升高(P<0.05)，加入Que(80、120和160 μmol/L)與TG共同作用后可使[Ca2+]i明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性；雖Que(160 μmol/L)單獨作用也可使[Ca2+]i較對照組升高(P<0.05)，但與TG共孵育時存在交互作用,見表2。

4Que對TG作用RAW264.7細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響

結果顯示，TG組細胞GRP78及CHOP蛋白表達明顯增加，其相對蛋白含量分別為對照組的9.36和21.6倍(P<0.05)；而Que(80、120和160 μmol/L)與TG共同作用使兩種蛋白表達均較TG組降低(P<0.05)，GRP78蛋白相對含量較TG組降低20%、61%和78%，CHOP蛋白相對含量較TG組降低56%、81%和79%,見圖2A。

160 μmol/L Que單獨作用RAW264.7細胞，不同時間點檢測蛋白表達變化，結果發現，GRP78和CHOP的蛋白水平均較對照組升高(P<0.05)，作用24 h時蛋白水平分別是對照組的3.55倍和1.75倍，但時間依賴性不明顯,見圖2B。

5Que通過PI3K通路抑制TG誘導的RAW264.7細胞ERS

結果顯示，LY294002(15 nmol/L)或Que(160 μmol/L)單獨作用，或是二者共同作用RAW264.7細胞時，都可以抑制TG誘導的GRP78和CHOP的表達上調(P<0.05)，GRP78較TG組分別降低74%、76%和77%，CHOP較TG組分別降低74%、76%和76%，而三者對兩種蛋白的抑制作用之間無統計學意義(P>0.05)，見圖2C。

討 論

內質網是蛋白質合成、修飾加工、分選轉運的主要場所，同時也參與調節細胞內Ca2+濃度變化。很多病理生理因素，如熱性驚厥、糖基化的抑制、Ca2+穩態失衡、二硫鍵結合減少、病毒感染等，都能干擾蛋白質折疊，使未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網腔內蓄積，引起ERS。隨后細胞引發一系列試圖恢復內質網穩態的反應，如降低翻譯水平來阻止蛋白質的進一步聚集，誘導分子伴侶GRP78、葡萄糖調節蛋白質94(glucose-regulated protein 94,GRP94)等的表達以糾正蛋白質的折疊及促進泛素-蛋白酶體降解系統，加速未折疊或錯誤折疊蛋白質的降解。這一系列反應稱之為未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，相關轉錄因子有：RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、肌醇激酶l(inositol-requiring kinase 1, IRE1)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)[3]。當應激持續過強或過久時，UPR可激活轉錄因子CHOP、caspase-12和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)等，誘導細

Figure 1. Effect of Que on apoptosis of RAW264.7 cells induced by TG. RAW264.7 cells were treated with various concentrations of Que and 1 μmol/L of TG for 24 h. The apoptotic rate was determinied by flow cytometry. The morphological changes of the cells was observed by laser scanning confocal microscopy (×200).

圖1Que對TG誘導RAW264.7細胞凋亡的影響

表2Que對TG誘導的RAW264.7細胞[Ca2+]i濃度的影響

Group[Ca2+]iControl31.65±2.94TG371.39±58.92*TG+80μmol/LQue292.61±11.01#TG+120μmol/LQue198.97±2.03#TG+160μmol/LQue162.78±3.19#160μmol/LQue121.14±1.54*

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTG.

圖2Que對TG誘導的RAW264.7細胞中GRP78和CHOP蛋白表達的影響

胞凋亡，導致不可逆的損傷[3]。研究發現，ERS伴隨AS發生、發展的全過程，可誘導斑塊中的巨噬細胞凋亡，是除死亡受體和線粒體途徑外，觸發巨噬細胞凋亡的另一重要機制[4]。

GRP78是ERS的標志蛋白之一。在未應激的細胞中，GRP78與IRE1、PERK、ATF6的胞內部分結合，使其失活；當ERS時其表達上調，激活感受器蛋白的同時，增加內質網對未折疊蛋白的處理能力[4]。CHOP是參與ERS凋亡途徑的重要信號分子,可通過多種途徑誘導細胞凋亡[5]。研究發現，在巨噬細胞中CHOP可通過活化內質網氧化酶1(ER oxidase 1, ERO1)，激活1，4，5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)相關的內質網Ca2+釋放，從而活化死亡受體FAS、線粒體等眾多凋亡信號通路[6]。

TG可通過抑制肌漿/內質網Ca2+-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)，使Ca2+穩態失衡誘導ERS。本實驗結果顯示，鼠源巨噬細胞RAW264.7經1 μmol/L TG處理24 h后，細胞存活率降低，凋亡率增加，可見凋亡形態變化及典型的凋亡小體,[Ca2+]i及GRP78、CHOP蛋白表達與對照組相比也有明顯增加。結果表明，TG誘導RAW264.7細胞ERS模型制備成功。

Que及其衍生物是植物界分布最廣的黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮，其藥理活性主要有抗氧化、抗炎、降血壓、抗血小板聚集、 抗癌變、抗AS等作用[7-9]。本實驗發現，Que可以減輕TG誘導的RAW264.7細胞ERS相關損傷，表現為細胞存活率上升，凋亡率下降，凋亡形態變化減輕，晚期凋亡及壞死細胞明顯減少，凋亡小體缺失，[Ca2+]i降低，凋亡標志蛋白GRP78及CHOP表達減少，且該效應呈劑量依賴趨勢。

Que單獨作用也可上調GRP78及CHOP的表達，以上調GRP78表達更為顯著，我們猜測，Que或許是通過上調GRP78表達，增強細胞對應激的防御能力。而且我們人體對黃酮類的日攝取量僅僅是20～35 mg/d[10]，實驗用的Que濃度已遠遠大于體內實際存在量。Takano等[11]研究發現，與Que具有相似生物學作用的甲基黃酮類代表-紅橘素在抑制衣霉素誘導的ERS時，會上調GRP78和血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1, HO-1)的表達；而紅橘素抑制小鼠胰島素瘤細胞MIN6 ERS的同時，也可上調GRP78表達并誘導翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)的磷酸化。據此我們推測，Que表現出的是對ERS的抑制作用，而不是加劇ERS的毒性作用。

已知Que與PI3K抑制劑LY294002具有相似的結構，能抑制PI3K-Akt /PKB信號通路[12]。我們發現，LY294002或Que單獨作用都可以抑制TG誘導的GRP78和CHOP的表達升高，而聯合應用時對蛋白的抑制作用與二者單獨作用時沒有統計學差異，此結果提示二者抑制TG誘導的GRP78和CHOP蛋白表達升高的機制是相同的，即Que或許是通過抑制PI3K通路來調節RAW264.7細胞ERS的。

有報道稱，PI3K能通過抑制糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)影響糖代謝，誘發葡糖胺誘導的ERS[13]。TG抑制SERCA后可使內質網腔Ca2+耗竭和[Ca2+]i升高，而后者導致PI3K活化[14]。PI3K活化能進一步激活磷脂酶Cγ(phospholipase C gamma, PLCγ)，產生IP3，通過與IP3R結合誘導內質網釋放Ca2+[15]，加重ERS。而且PI3K還能通過活化JNK、促進CHOP表達和失活 Bcl-2等誘導細胞凋亡[16]。因此，抑制PI3K信號通路或許能直接導致ERS的緩和。

綜上所述，Que可以抑制TG誘導的巨噬細胞RAW264.7內質網應激凋亡途徑，其機制可能與抑制PI3K信號通路和抑制CHOP蛋白的表達有關。

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ProtectiveeffectofquercetinonERstress-relatedapoptosisinducedbythapsigargininmacrophages

YUE Wen1, YAO Shu-tong1, BAO Ying2,WANG Jia-fu1, YANG Na-na3, SHANG Zhan-ping1

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofCardiovascularMedicine,theCentralHospitalofTaian,3InstituteofAtherosclerosis,TaishanMedicalCollege,Taian271000,China.E-mail:zhpshang@tsmc.edu.cn)

AIM: To investigate the effects and possible mechanisms of quercetin (Que) on endoplasmic reti-culum stress (ERS)-related apoptosis induced by thapsigargin (TG) in RAW264.7 cells.METHODSER stress of RAW264.7 cells were induced by TG at concentration of 1 μmol/L for 24 h. After treated with different concentrations of Que (80, 120 and 160 μmol/L), the cell viability was determined by MTT assay.The apoptotic rate and the changes of intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) were determined by flow cytometry, and the cell apoptotic morphology was observed under laser scanning confocal microscope.The protein levels of glucose-regulated protein 78 (GRP78) and C/EBP homologous protein (CHOP) were detected by Western blotting. The effect of Que on GRP78 and CHOP induced by TG with phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inihibitor LY294002 at concentration of 15 nmol/L was measured by Western blotting.RESULTSQue suppressed ER stress-related injury induced by TG in RAW264.7 cells. Compared with TG group, the cell viability increased (P<0.05), apoptotic rate and [Ca2+]idecreased (P<0.05) and the changes of apoptotic morphology were alleviated. The increase in GRP78 and CHOP induced by TG as an ER stress marker was suppressed by Que (P<0.05). The suppressive effect of Que on GRP78 and CHOP was reproduced by LY294002 (P<0.05), but they failed to exhibit additive suppression.CONCLUSIONQue suppresses the ER stress induced by TG in RAW264.7 cells. The protective effect may be related to its suppression on PI3K signaling pathway.

Quercetin; Endoplasmic reticulum stress; Macrophages; Apoptosis; Phosphatidylinositol 3-kinase

R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.023