白細胞介素-1β在病理性疼痛大鼠脊髓LTP中的作用及機制*

鐘 祎， 黃陽亮， 許繼德

(1廣州醫學院生理教研室，廣東 廣州 510182 ；2中山大學附屬第一醫院脊柱外科，廣東 廣州 510700)

1000-4718(2012)03-0541-05

2011-09-20

2012-01-05

廣州醫學院博士啟動基金資助項目(No.2010C12)

△通訊作者 Tel：020-81340199; E-mail：victoria0720@126.com

白細胞介素-1β在病理性疼痛大鼠脊髓LTP中的作用及機制*

鐘 祎1△， 黃陽亮2， 許繼德1

(1廣州醫學院生理教研室，廣東 廣州 510182 ；2中山大學附屬第一醫院脊柱外科，廣東 廣州 510700)

目的探討白細胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)在神經病理性疼痛大鼠脊髓背角C纖維誘發電位長時程增強(long-term potentiation, LTP)中的作用及其機制。方法用坐骨神經部分損傷(spared nerve injury, SNI)和腰5前根切斷(lumbar 5 ventral root transection, L5 VRT)方法復制大鼠病理性疼痛模型，觀察外源性IL-1β對正常大鼠及病理性疼痛模型大鼠脊髓背角C纖維誘發電位的影響，并且檢測p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase)和NF-κB (nuclear factor-kappa B)信號通路在其中的作用。結果500 μg/L IL-1β對正常大鼠C纖維介導的基本突觸傳遞和高頻刺激誘導的LTP都沒有影響，而5 μg/L的IL-1β可以在神經病理性疼痛模型的大鼠上誘導出LTP。預先用p38 MAPK或NF-κB的抑制劑(SB203580或PDTC)可以完全阻斷IL-1β誘導的LTP。結論外源性IL-1β可誘導神經病理性疼痛大鼠脊髓背角C纖維誘發電位的LTP。p38 MAPK和NF-κB信號通路可能參與這一過程。

白細胞介素-1; 長時程增強; p38 MAPK; NF-κB

突觸傳遞效率的長時程增強(long-term potentiation， LTP)現象最早是在海馬發現的，是現在公認的研究學習和記憶的突觸模型[1]。在中樞神經系統的其它部位比如脊髓也發現電刺激傳入C纖維以及末梢神經損傷可以誘導脊髓背角LTP[2-3]。由于傳入C纖維傳遞痛覺信息并與脊髓淺層神經元形成突觸聯系,脊髓LTP被認為是一種痛覺記憶,是目前研究病理性疼痛的突觸模型[4]。

大量文獻表明，海馬LTP和脊髓LTP有著許多相同的機制。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)、蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A, PKA)和鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶II (calcium/calmodulin-dependent protein kinases II, CaMKII)在海馬LTP和脊髓LTP的作用方式相同[5]。激活多巴胺D1/D5受體或者原肌球蛋白相關受體B(tropomyosin-related kinase B, TrkB)受體可以誘導海馬和脊髓背角LTP[6-7]。很顯然，以這些分子為靶點的藥物可以治療病理性疼痛但同樣會帶來嚴重的并發癥——記憶功能受損。因此選擇性地抑制脊髓LTP非常重要。

致炎細胞因子比如腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor α, TNF-α)和白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)在突觸可塑性中起重要作用。病理濃度下它們可以抑制海馬CA1、CA3和齒狀回的LTP[8-9]。本研究的目的就是探討可以引起病理性疼痛的IL-1β對脊髓LTP的影響及其機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重220～280 g，均由廣州醫學院實驗動物中心提供。動物分籠飼養，自由飲食。室溫及室內相對濕度分別維持在(24±1)℃和(55±5)%，所有實驗步驟均按照有關實驗動物的使用原則操作。

1.2主要試劑 重組大鼠IL-1β (Calbiochem), PDTC (NF-kappa B抑制劑，Sigma)首先溶解在0.9%生理鹽水中配成儲存液,分裝儲存在-80 ℃冰箱中。使用前用0.9%生理鹽水稀釋成所需濃度。SB203580 (p38 MAPK 抑制劑，Sigma)和SP600125 (JNK抑制劑，Calbiochem)先用DMSO溶解為50 mmol/L的母液,使用前再用0.9%生理鹽水稀釋。抑制劑預處時間為60 min，處理后吸出剩余抑制劑，再于脊髓表面加入IL-1β觀察抑制劑對IL-1β作用的影響，IL-1β的作用時間一直維持到實驗結束。所有藥物使用前先在恒溫水浴箱中預熱到37 ℃再加于脊髓表面。

2方法

2.1疼痛模型制作

2.1.1坐骨神經部分損傷(spared nerve injury, SNI)模型[10]2 %氟烷麻醉大鼠，剔除大鼠左大腿毛發，0.5%氯已定消毒手術部位。剪開大腿外側皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經及其3個分支：腓腸神經、腓總神經和脛神經。用5.0絲線緊緊結扎腓總神經和脛神經，并從結扎遠端剪掉2～4 mm。注意不要損傷腓腸神經，傷口分層縫合, 待動物蘇醒后,與術前同條件喂養。

2.1.2腰5前根切斷(lumbar 5 ventral root transection, L5 VRT)模型[11]苯巴比妥鈉(50 mg/kg, 腹腔注射)麻醉動物,所有操作在左側脊柱進行。手術過程遵循無菌原則。剔除大鼠下背部的毛發,暴露皮膚。0.5%氯已定消毒手術部位,鋪手術巾,使用消毒過的手術器械。從大鼠脊柱旁約腰4～骶2(L4～S2)脊髓節段處縱行劃開皮膚,去除L5節段上下的肌肉組織,用咬骨鉗移去左側L6橫突后暴露L4～L5脊神經,用玻璃分針小心分離L5脊神經并用3.0醫用縫合線牢固結扎并切斷,逐層縫合切口,待動物蘇醒后,與術前同條件喂養。

2.2行為學測試[12]為了讓大鼠熟悉測試環境,消除大鼠心理因素對測試結果的影響，于測試前1周把大鼠放于測試箱內15～20 min,隔天1次, 共3 次。于造模后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d進行痛行為學測試。測試箱為透明有機玻璃箱(18 cm×25 cm×18 cm),箱底為金屬網制成(網格為0.8 cm×0.8 cm),通過網孔用von Frey hair可以對大鼠足底部皮膚施加機械性刺激。刺激后大鼠出現迅速的撤足或舔足視為陽性反應。僅僅出現了撤足閾值明顯降低的模型動物才用做電生理實驗。

2.3電生理記錄 根據行為測試的結果，取造模后7 d的動物(此時已出現明顯的痛覺過敏)進行電生理記錄。烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉，行氣管插管使大鼠自然呼吸；一側頸動脈插管持續監測大鼠血壓(波動于80～120 mmHg)；在腰4～腰6(L4～L6)間行椎板切除術，暴露腰膨大。游離左側坐骨神經，使用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經。除用于記錄的脊髓節段(腰膨大部位：L4～L6)外，暴露的神經組織均用石蠟油覆蓋。用熱反饋式電熱毯使大鼠肛溫維持在37.0～37.5 ℃。脊髓背角C纖維誘發電位的記錄方法如下： 通過氯化銀電極電刺激游離的左側坐骨神經以誘發脊髓場電位，鎢絲微電極(電阻0.5～1 MΩ)進行細胞外記錄，用電控的微量推進器(Narishige Scientific Instrument Laboratory)將電極深度控制在脊髓表面下100～500 μm。用數/模轉換器(ADC-42. PICO)以10 kHz的速度處理和儲存數據。以C纖維誘發電位的幅度作為參數。單方波(10～20 V，0.5 ms，1 min)刺激分離的左側坐骨神經誘發脊髓背角電位，高頻刺激(40 V，0.5 ms，100 Hz，持續1 s，間隔10 s，4次)誘導C纖維誘發電位LTP。坐骨神經的刺激點到脊髓背角的記錄點約為11 cm。每只動物只做1次實驗,每只動物電生理記錄總時間約為7 h。實驗結束后腹腔注射過量的烏拉坦處死動物。

3統計學處理

結 果

1正常大鼠脊髓表面給予IL-1β不影響高頻刺激誘導的脊髓背角LTP

圖1B顯示,在不同濃度的IL-1β (5 μg/L, 50 μg/L, 500 μg/L; 200 μL)的作用下，高頻刺激誘導的LTP水平和生理鹽水作用下高頻刺激誘導的LTP水平無顯著差異(P>0.05)。500 μg/L IL-1β 對C纖維介導的基本突觸傳遞亦無顯著影響,見圖1。

2神經損傷大鼠脊髓表面給予IL-1β可以誘導脊髓背角LTP

在SNI模型大鼠脊髓表面給予濃度低至5 μg/L (200 μL) IL-1β可以引起脊髓背角LTP。給予IL-1β 30 min后,脊髓背角C纖維誘發的場電位明顯增加(143.2±11.8)% (P<0.05),165 min后場電位增加到(250.8 ± 17.5)%(P<0.05),并且在此水平維持到實驗結束(n=7)。而IL-1β的溶劑生理鹽水對C纖維誘發電位沒有顯著影響(P>0.05)，見圖2A。IL-1β (5 μg/L, 200 μL)及溶劑生理鹽水對正常大鼠的基礎電位沒有顯著影響(P>0.05)，見圖2C。為了進一步驗證這個結果,我們在L5 VRT模型大鼠上進行了相同的實驗,結果與前面相似, 脊髓表面給予IL-1β可以誘導脊髓LTP (P<0.05)，見圖2B。

圖1進正常大鼠脊髓表面給予IL-1β不影響C纖維介導的基本突觸傳遞，也不影響高頻刺激誘導的脊髓背角LTP

3p38MAPK和NF-κB信號通路在IL-1β誘導的脊髓背角LTP中的作用

在給IL-1β之前60 min,脊髓表面給予p38 MAPK抑制劑SB203580或NF-κB 抑制劑PDTC或JNK抑制劑SP600125, 結果顯示,SB203580 (100 μmol/L, 200 μL) 和PDTC (10 pmol/L, 200 μL)可以阻斷IL-1β誘導的LTP，而SP600125 (100 μmol/L，200 μL)未能阻斷IL-1β誘導的LTP,見圖3。這表明IL-1β通過激活p38 MAPK和NF-κB信號通路誘導神經損傷大鼠脊髓背角LTP。

討 論

1致炎癥細胞因子在脊髓LTP和海馬LTP中作用不同

大量文獻表明病理濃度的TNF-α 和IL-1β可以抑制高頻刺激誘導的海馬LTP[13-14]。而現在我們的研究發現脊

圖2神經損傷大鼠脊髓表面給予IL-1β可以誘導C纖維誘發電位的LTP

圖3p38MAPK和NF-κB信號通路而不是PDTC通路參與IL-1β誘導的LTP

髓背角給予IL-1β既不影響正常大鼠脊髓的基本突觸傳遞也不影響高頻刺激誘導的脊髓LTP，但是在神經損傷(SNI或L5 VRT)引起的病理性疼痛大鼠上可以誘導出脊髓LTP。IL-1β對脊髓背角可塑性的影響和TNF-α 幾乎相同。這些結果都支持我們的推測，即致炎細胞因子對海馬和脊髓背角突觸可塑性的影響完全不同。在海馬和脊髓背角都存在LTP現象，海馬是學習記憶的結構基礎，海馬LTP也是學習記憶的突觸模型；而脊髓背角是感覺傳入的第一級換元部位，脊髓LTP是病理性疼痛的突觸模型。以往的研究發現脊髓LTP和海馬LTP存在許多相同機制，而我們的研究發現了IL-1β在兩種LTP中的作用完全相反，以IL-1β為靶點治療病理性疼痛不會損害海馬LTP，從而可以避免損害學習記憶功能。

2致炎癥細胞因子對突觸可塑性作用的機制

有文獻報道生理濃度的TNF-α引起神經元表面AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methl-4-isoxalzole propionic acid)受體表達增加，從而增加突觸傳遞效率[15]。白細胞介素-1受體基因敲除小鼠的海馬記憶功能受損，并且海馬CA1區和齒狀回的LTP完全消失[16]。這些數據表明海馬記憶功能和長時程突觸可塑性都需要TNF-α和IL-1的參與。然而，病理濃度的TNF-α 和 IL-1β通過激活p38 MAPK、JNK 和 NF-κB信號通路抑制海馬LTP[17-19]。在脊髓背角TNF-α通過激活p38 MAPK、JNK 和 NF-κB信號通路誘導神經損傷大鼠的脊髓背角LTP[20]。我們現在的研究發現p38 MAPK 和 NF-κB 的抑制劑可以完全阻斷IL-1β誘導的脊髓LTP，但JNK的抑制劑沒有此效果。這表明JNK信號通路對TNF-α誘導的LTP很重要，但是并不參與IL-1β誘導的LTP。

3外周神經損傷時致炎癥細胞因子的來源

有研究表明，外周神經損傷時，脊髓背角膠質細胞(包括小膠質細胞和星形膠質細胞)大量激活，活化的膠質細胞合成并釋放致炎細胞因子(包括TNF-α 、IL-1β、IL-6等)，參與神經病理性疼痛的產生和維持[21]。我們早期的研究也發現，脊髓背角小膠質細胞的活化是誘導脊髓LTP的必要條件[22]，因此推測脊髓背角的膠質細胞通過致炎細胞因子參與脊髓LTP及病理性疼痛的誘導和維持。

綜合已有的研究和本實驗結果，我們認為海馬LTP和脊髓LTP機制并不完全相同，致炎癥細胞因子TNF-α 和IL-1β在2種LTP中的作用完全相反，而外周神經損傷時，活化的膠質細胞合成并釋放致炎細胞因子，因此以膠質細胞及致炎細胞因子為靶點的藥物可以選擇性抑制脊髓LTP，治療病理性疼痛的同時不損害海馬的學習記憶功能。

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Roleofinterleukin-1βinspinalLTPinratswithneuropathicpain

ZHONG Yi1, HUANG Yang-liang2, XU Ji-de1

(1DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510182,China;2DepartmentofSpineSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China.E-mail:victoria0720@126.com)

AIM: To investigate the role of interleukin-1β (IL-1β) in the long-term potentiation (LTP) of C-fiber-evoked field potentials in rats with neuropathic pain.METHODSThe rat model of neuropathic pain was produced by spared nerve injury (SNI) of sciatic nerve or the method of lumbar 5 ventral root transection (L5 VRT). The effect of exogenous IL-1β on C-fiber-evoked field potentials of spinal dorsal horn was tested in both intact rats and the rats with neuropathic pain. The roles of p38 MAPK and NF-κB in the process were also evaluated.RESULTSIL-1β at concentration of 500 μg/L affected neither basal synaptic transmission mediated by C-fiber nor spinal LTP induced by high frequency stimulation in intact rats. However, low concentration (5 μg/L) of IL-1β induced LTP of C-fiber-evoked field potentials in the rats with neuropathic pain. Pretreatment with either p38 MAPK inhibitor (SB203580) or NF-κB inhibitor (PDTC) completely blocked LTP induced by IL-1β.CONCLUSIONExogeneous IL-1β might induce spinal LTP of C-fiber-evoked field potentials in the rats with neuropathic pain. p38 MAPK and NF-κB may be involved in the process.

Interleukin-1; Long-term potentiation; p38 MAPK; NF-kappa B

R338

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.028