天然藻藍蛋白對SD大鼠的長期毒性研究

宋璐非 劉 冰 趙 勇 田景振 秦 松

1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所生物資源實驗室，山東煙臺 264003；3.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264000

天然藻藍蛋白對SD大鼠的長期毒性研究

宋璐非1劉 冰2趙 勇3田景振1秦 松2

1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所生物資源實驗室，山東煙臺 264003；3.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264000

目的 研究天然藻藍蛋白對SD大鼠的長期毒性。 方法 將天然藻藍蛋白水溶液分為高、中、低3個劑量與蒸餾水對照，對80只SD大鼠連續灌胃12周，恢復4周。除觀察動物一般狀態外，第12、16周分別對給藥末期大鼠及恢復期結束的大鼠進行連續處死，檢測血常規、血生化指標，精密量取心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，計算其臟器系數，并進行常規病理檢查。 結果 天然藻藍蛋白對大鼠的一般狀態、血常規、血生化指標、主要臟器質量系數及組織病理均無明顯影響。停藥4周后上述結果未見明顯異常。與空白對照組比較，未見與天然藻藍蛋白相關的明顯異常。結論大鼠長期毒性試驗表明天然藻藍蛋白口服無毒性。

天然藻藍蛋白；SD大鼠；長期毒性

藻藍蛋白（Phycocyanin）是從螺旋藻中提取的天然捕光色素蛋白，屬于藻膽蛋白（Phycobiliprotein）的一種。Romay等[1]第一次報道從藍藻中提取的藻藍蛋白具有抗氧化和抗炎作用，藻藍蛋白還能抑制肝臟微粒脂過氧化物生成（IC50=12 mg/mL）。此外藻藍蛋白和藻紅蛋白的抗氧化活性也相繼被證實[2-4]。Morcos等[5]首先發現了藻藍蛋白的激光致細胞毒作用并對骨髓造血具有刺激作用。現已證實藻藍蛋白能在適宜波長光的激發下，產生單線態氧和其他的氧自由基[6]用于腫瘤細胞光動力治療。最近報道顯示藻藍蛋白對人肺腺同樣有抑制作用[7]。在國內，劉宇峰等[8]證明螺旋藻藻藍蛋白（C-PC）對K562（白血?。┘毎囊种菩Ч己?。關燕清等[9]發現固定在聚苯乙烯（PSt）基板上藻藍蛋白對體外肝癌細胞7402有抑制作用。目前對藻藍蛋白的各種藥理藥效學研究已經積累了大量數據可供參考并且展示了開發成各種功能食品及藥物的良好前景，但對其毒理學研究鮮見報道。本試驗用自提天然藻藍蛋白對SD大鼠進行長期毒性試驗研究，為以后開發藻藍蛋白為主要成分的功能食品和藥物提供依據。

1 材料與儀器

1.1 受試藥物的制備

食品級螺旋藻粉購自江蘇賜百年公司，藻藍蛋白從螺旋藻中提取[10]，純度 1.0（A620/A280）。

1.2 受試動物與飼養條件

SPF級SD大鼠購自綠葉制藥[SCXK（魯）20090009]。80只，雌雄各半，6～9周齡。適應性喂養一周，動物身體健康，無異常狀況，試驗開始時體質量差異不超過±20%。

飼養條件：飼養于塑料籠（350mm×24 mm×170 mm）內，每籠 1只。室溫（22±2）℃，相對濕度 50%～70%，控制光 12 h，黑暗12 h。自由取水和食料，定期更換墊料。

1.3 設備與試劑

CA-500血球計數儀（AITAIKE），溶血素（山東蘭橋醫學科技有限公司），稀釋液 （煙臺卓越生物技術有限公司），TBA-40FR全自動生化分析儀（東芝，日本），檢測試劑（中生北控生物科技股份有限公司）。

2 試驗方法

2.1 動物分組

將80只SD大鼠按體重隨機分為蒸餾水對照組與高、中、低三個劑量組，共4組，每組20只，雌雄各10只。

2.2 給藥途徑與劑量設計

灌胃，每次口服容量 1mL/（100 g·d）。

根據天然藻藍蛋白經口急性毒性試驗結果，12 g/kg無毒性反應和預試驗結果，確定SD大鼠天然藻藍蛋白長期毒性試驗高劑量組為4.00 g/kg，中劑量組為0.40 g/kg，低劑量組為0.12 g/kg，對照組為蒸餾水。

2.3 檢測指標

檢測指標及時間見表1。

2.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 11.5對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠一般狀況及體質量的影響

各組動物發育良好，皮毛光澤，行為正常，大小便與對照組無差異，眼、鼻無異常分泌物，攝食正常。恢復期4周內無異常表現。連續給藥12周及恢復期4周各組體質量逐周增加，各組體質量增長量差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥12周及停藥4周，各給藥組大鼠的進食量與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 對大鼠外周血常規的影響

給藥12周末次給藥24 h后，連續處死大鼠，腹腔動脈取血。血常規各項指標均在正常值范圍內，給藥組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2、3?；謴推?周末次給藥24 h后，重復以上試驗差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.3 對大鼠血液生化指標的影響

給藥12周末次給藥24 h后連續處死大鼠，腹腔動脈取血后靜置30min，3 000 r/min離心10 min后去上清液，得到血清進行血液生化指標檢查。結果與對照組比較，天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、血清尿素氮（BUN）、總膽固醇（T-CHO）、血糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、總膽紅素（TBIL）等含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、5?；謴推?周末次給藥24 h后，重復以上試驗差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 檢測時間及指標

表2 天然藻藍蛋白對大鼠血常規的影響（，n=6）

表2 天然藻藍蛋白對大鼠血常規的影響（，n=6）

組別 劑量（g/kg） 雌性給藥12周RBC（1012/L） Hb（g/L） PLT（109/L） WBC（109/L） N（%） L（%）蒸餾水對照組藻藍蛋白低劑量組藻藍蛋白中劑量組藻藍蛋白高劑量組-0.12 0.40 4.00 8.16±1.00 7.86±1.62 9.07±1.70 8.83±1.27 161.64±19.30 157.89±21.56 150.37±24.98 172.43±26.77 876.55±139.39 913.36±159.58 826.93±148.63 896.50±123.39 6.02±1.54 5.22±1.95 5.89±1.23 5.13±2.01 75.93±15.73 83.58±17.65 79.35±16.08 80.78±20.01 20.31±15.43 22.40±17.02 19.21±16.88 25.34±20.10

表3 天然藻藍蛋白對大鼠血常規的影響（，n=6）

表3 天然藻藍蛋白對大鼠血常規的影響（，n=6）

組別 劑量（g/kg） 雄性給藥12周RBC（1012/L） Hb（g/L） PLT（109/L） WBC（109/L） N（%） L（%）蒸餾水對照組藻藍蛋白低劑量組藻藍蛋白中劑量組藻藍蛋白高劑量組-0.12 0.40 4.00 9.20±1.08 9.77±1.49 8.20±1.38 9.53±1.36 169.54±29.22 173.81±22.79 155.63±32.12 168.53±27.12 935.30±166.19 850.52±183.37 822.30±176.54 900.00±170.82 7.70±2.75 7.58±2.89 8.03±3.08 8.14±3.25 76.53±15.67 79.78±17.84 80.82±18.33 88.72±18.79 24.39±15.29 21.57±13.67 19.76±16.69 28.50±19.24

表4 天然藻藍蛋白對雌性大鼠血液生化指標的影響（，n=6）

表4 天然藻藍蛋白對雌性大鼠血液生化指標的影響（，n=6）

檢測指標 雌性給藥12周藻藍蛋白低劑量組（0.12 g/kg） 藻藍蛋白中劑量組（0.40 g/kg）藻藍蛋白高劑量組（4.00 g/kg）蒸餾水對照組丙氨酸氨基轉換酶（ALT，U/L）天冬氨酸氨基轉換酶（AST，U/L）堿性磷酸酶（ALP，U/L）總蛋白（TP，g/L）白蛋白（ALB，g/L）尿素氮（BUN，mmol/L）肌酐（CREA，μmol/L）血糖（GLU，mmol/L）三酰甘油（TG，mmol/L）總膽固醇（T-CHO，mmol/L總膽紅素（TBIL，mmol/L）肌酸激酶（CK，mmol/L）60.13±23.33 188.38±54.04 72.88±50.44 69.94±5.88 36.84±5.81 7.14±1.79 50.06±12.31 4.27±1.83 0.47±0.16 1.98±1.04 4.82±1.59 510.29±195.74 61.18±21.12 192.49±58.77 68.42±56.39 72.88±5.01 39.11±5.49 7.28±1.71 49.69±10.85 4.40±1.07 0.49±0.23 2.23±1.64 4.54±1.78 447.75±247.93 59.68±20.77 194.69±56.87 77.56±49.33 66.99±7.21 41.22±6.02 7.01±1.92 51.80±12.35 4.06±1.58 0.57±0.29 2.15±0.84 4.98±1.74 558.35±227.49 63.64±23.52 179.47±61.21 76.29±55.27 69.37±5.62 40.79±5.85 7.33±1.95 51.29±12.54 4.78±1.87 0.55±0.28 2.07±0.85 4.23±1.92 568.28±272.34

表5 天然藻藍蛋白對大鼠血液生化指標的影響（，n=6）

表5 天然藻藍蛋白對大鼠血液生化指標的影響（，n=6）

檢測指標 雄性給藥12周藻藍蛋白低劑量組（0.12 g/kg） 藻藍蛋白中劑量組（0.40 g/kg） 藻藍蛋白高劑量組（4.00 g/kg）蒸餾水對照組丙氨酸氨基轉移酶（ALT，U/L）天冬氨酸氨基轉移酶（AST，U/L）堿性磷酸酶（ALP，U/L）總蛋白（TP，g/L）白蛋白（ALB，g/L）尿素氮（BUN，mmol/L）肌酐（CREA，μmol/L）血糖（GLU，mmol/L）三酰甘油（TG，mmol/L）總膽固醇（T-CHO，mmol/L）總膽紅素（TBIL，mmol/L）肌酸激酶（CK，mmol/L）73.69±24.12 175.89±47.88 104.07±46.98 70.13±6.12 36.96±5.12 7.27±1.87 47.25±16.51 4.28±0.93 0.55±0.15 1.87±0.56 4.43±2.17 743.53±242.56 74.69±22.17 181.43±48.64 110.58±43.94 67.12±5.95 38.25±5.70 7.40±1.92 45.71±16.98 4.17±0.98 0.59±0.18 1.77±0.58 4.76±2.04 710.53±293.06 75.79±25.41 169.69±50.34 117.09±47.15 69.54±6.17 36.84±5.92 7.45±1.97 45.00±17.62 4.09±1.02 0.66±0.23 1.75±0.61 4.55±2.11 684.50±310.54 72.11±23.62 173.32±43.75 117.88±48.60 70.33±5.80 37.51±5.83 7.36±1.98 48.50±16.68 4.40±1.13 0.64±0.21 1.91±0.62 4.58±2.09 773.53±294.24

3.4 對大鼠臟器系數的影響

大鼠給藥第12周后和恢復至16周時，解剖取心、肺、肝、脾、腎、腦、腎上腺、胸腺、睪丸/卵巢和前列腺/子宮，稱其絕對重量并計算以上器官各占100 g體質量的相對重量。結果表明，藻藍蛋白不影響動物臟器重量。

3.5 對大鼠重要臟器病理組織學檢查

第12周解剖時，取心、肺、肝、脾、腎、腦、甲狀腺、腎上腺、胸腺、副睪、前列腺/子宮和睪丸/卵巢、胃、十二指腸、回腸、結腸、胰腺、眼球及視神經、胸骨和骨髓，肉眼觀察其外觀和形態，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。HE染色后，光鏡下觀察各劑量給藥組大鼠器官組織結構未發現組織萎縮、增長和炎癥細胞浸潤，未見明顯的與受試物相關的病理性損傷。恢復至16周時各給藥組以上組織器官與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

4 討論

本研究用自提天然藻藍蛋白對SD大鼠進行系統的長期毒性試驗研究。結果顯示，天然藻藍蛋白以4.00、0.40、0.12 g/kg的劑量，對SD大鼠連續灌胃給藥12周，對大鼠的體質量、飲食、飲水無不良影響；定期檢測的RBC、PLT、WBC血常規以及 ALT、AST、ALP、TBIL、CREA 等血液生化指標都在正常范圍內，并且與灌胃樣品量無劑量依賴相關性，無明顯的血常規毒性；對肝、脾、腎等重要臟器組織結構以及主要臟器系數的觀察，未見明顯腫脹、壞死以及炎癥反應，綜合以上結果表明樣品口服無肝臟毒性。經過4周恢復期后檢測上述各指標均未見明顯異常，并且高、中、低劑量組數據與蒸餾水對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示上述指標在停止灌胃后未見其他明顯的后遺效應和繼發毒性變化。對比已有的相關文獻報道，結合大鼠長期毒性試驗結果表明，天然藻藍蛋白口服無毒性，屬于實際無毒物，具有進一步開發成為功能食品和藥物的價值。

[1]Romay C，Armesto J，Remirez D，etal.Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae [J].Inflamm Res，1998，47（1）：36-41.

[2]俞麗君，李永明，陳艷麗，等.鈍頂螺旋藻藻膽蛋白的純化及其清除氧自由基的作用[J].臺灣海峽，1999，18（2）：172-176.

[3]Bermejo P，Pinero E，Ma A.Villar Iron-chelating ability and antioxidant properties of phycocyanin isolated from a protean extract of Spirulina platensis[J].Food Chemistry，2008，110：436-445.

[4]Manconia M，Pendas J，Ledon N，et al.Fadda Phycocyanin liposomes for topical anti-inflammatory activity：in-vitro in-vivo studies[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61：423-430.

[5]Morcos NC，Berns M，Henry WL.Phycocyanin：laser activation，cytotoxic effects，and uptake in human atherosclerotic plaque[J].Lasers Surg Med，1988，8（1）：10-17.

[6]He JA，Hu YZ，Jiang LJ.Photodynamic action of phybiliproteins in situ generation of reactive oxygen species[J].J Biochim Biophys Acta：Bioenergetics，1997，1320（1）：165-174.

[7]Zhang X，Li JY，Gong XG.Isolation of C-PC subunits from spirulina platensis and inhibitory effect on SPC-A-1 cell line [J].Journal of Zhejiang University：Science Edition，2010，37（3）：319-323.

[8]劉宇峰，程霓.螺旋藻藻藍蛋白對人血癌細胞K562生長的影響[J].南京大學學報：自然科學版，2000，36（5）：640-642.

[9]關燕清，徐和德，郭寶江.光固定化藻藍蛋白對體外肝癌細胞7402的抑制作用[J].離子交換與吸附，2000，16（6）：547-552.

[10]吳蕾，龐廣昌，陳慶森.螺旋藻藻藍蛋白的規?；崛『蜕V純化技術研究進展[J].食品科學，2008，29（4）：461-463.

Chronic toxicity study of Phycocyanin on Sprague Daw ley rats

SONG Lufei1 LIU Bing2 ZHAO Yong3 TIAN Jingzhen1 QIN Song2
1.School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Ji′nan 250355,China;2.Biological Resources Laboratory,Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Shandong Province,Yantai 264003,China;3.College of Life Sciences,YantaiUniversity,Shandong Province,Yantai 264000,China

Objective To investigate the chronic toxicity induced by oral administration of Phycocyanin to Sprague Dawley rats.MethodsRats were randomly divided into four groups:control group,which

the distilled water,and three treatmentgroups,which received oral administration of high,medium and low doses of Phycocyanin.Totally 80 SD ratswere continuously administrated for 12 weeks,and then recovered for 4 weeks.Except for general factors such as bodyweight,food consumption and daily behavior,the routine biochemical blood indictors,the organ/bodyweight rate,the pathological changes of important organs such as heart,liver,spleen,lung,kidney,brain were also detected after 12 weeks and 16 weeks.The viscera coefficientwas calculated,and pathologicalwas examed routinely.ResultsThere was no significant influence of Phycocyanin on the blood routine,serum indictors and organ/bodyweight rate of the three dose group rats.ConclusionTheResultsof long-term toxicity experiment show that oral administration of Phycocyanin is safe.

Phycocyanin;SD Rats;Chronic toxicity

R948

A

1673-7210（2012）11（c）-0015-04

國家海洋局海洋公益性行業科研專項經費項目（項目編號：201205027）。

宋璐非（1985-），男，山東濟南人，碩士研究生，主要從事中藥新藥、新劑型的研究。

田景振，教授，博士生導師；秦松，研究員，博士生導師。

2012-06-27 本文編輯：衛 軻）