單壁納米碳管聯合吡柔比星對膀胱腫瘤抑制效應研究＊

易正金，陳 剛，張 堯，Shiv Kumar Yadav，何云鋒△

（1.攀枝花鋼鐵公司職工總醫院泌尿外科，四川攀枝花617023；2.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 400016；3.重慶醫科大學 400016）

膀胱癌是中國泌尿外科最常見的惡性腫瘤，膀胱癌的治療包括可見腫瘤的切除以及后續的膀胱灌注化療。但在經綜合治療的患者中，45%的患者會再發，再發患者中20%～30%的患者腫瘤會發展成為浸潤性膀胱癌[1]。而且，部分患者因不能夠耐受化療藥物的不良反應而不能完成膀胱灌注化療。因此尋找一種安全、有效的，且能有效降低化療藥物不良反應的藥物載體成為泌尿外科工作者亟待解決的課題。

1 材料與方法

1.1 材料 修飾的單壁納米碳管（SWNT）－吡柔比星（THP）復合物的制備：將SWNT和0.2 mmol／L的磷酸支鏈乙二醇混合，在超聲碎化的條件下反應30 min，然后反復過濾、沖洗、制備出活化的SWNT。在超聲碎化的條件下根據說明書將琥珀酰酐和THP反應，使琥珀酰酐中的羧酸基團結合在THP上；將修飾的SWNT在8 mmol／L N－羥基丁二酰亞胺和8 mmol／L 1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽條件下在搖床上反應6 h。用p H為7.4的PBS將ACNP－THP混合溶液同比例稀釋。多余的沒有反應的THP分子通過濾器和反復PBS沖洗清除掉。SWNT的長度在100～150 nm之間。SWNT的載藥量為每毫升SWNT含THP 10 mg。

1.2 SWNT－THP對人膀胱癌BIU－87細胞抑制作用研究 BIU－87細胞（購自上海細胞庫）在含10%胎牛血清（Hyclone公司）的1640培養基中培養（Hyclone公司）。胰蛋白酶消化后將細胞制懸，接種在6孔板中，分別加入SWNT、THP和SWNT－THP復合物共培養8 h。CSFE增值試劑盒（白云山公司）用于檢測細胞活性。CSFE加入細胞懸液在黑暗中反應10 min，然后通過加入等體積的含血清細胞培養液終止染色，同時用無菌水沖洗。熒光強度通過倒置顯微鏡以及流式細胞儀檢測。

1.3 大鼠原位膀胱癌模型的建立 60只8周齡的SD大鼠用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）行膀胱灌注，每次每只大鼠注射0.2 mg，每兩周1次，一共4次。第9周末取大鼠膀胱行病理學檢查。建模成功的42只大鼠被隨機分成4組（SWNT組6只，THP組15只，SWNT－THP復合物組15只，生理鹽水組6只），分別用SWNT、THP、SWNT－THP復合物以及生理鹽水行膀胱灌注治療。THP的用量標化到5 mg／kg。

1.4 THP釋放檢測 灌注治療后0、1、2、4 h，通過膀胱穿刺取大鼠尿液，用分光光度計研究大鼠尿液THP濃度。標準濃度曲線用萬樂公司提供的THP標準品建立。

1.5 體內腫瘤抑制作用檢測 灌注化療后2 d，從每組中隨機選取2只大鼠，取大鼠膀胱腫瘤組織。將腫瘤組織通過剪碎、研磨制備成腫瘤細胞懸液。腫瘤細胞通過PI染色行流式細胞檢查凋亡率。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示，組間比較采用ANOVA或者t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3種材料對BIU－87細胞抑制作用 SWNT對BIU－87細胞無明顯抑制效應；THP和SWNT－THP可明顯抑制BIU－87細胞增殖，其中SWNT－THP作用更明顯。SWNT、THP和SWNT－THP對BIU－87細胞的抑制率分別為（1.74±0.56）%、（51.24±1.45）%和（74.35±2.56）%。

圖1 3種材料對BIU－87細胞抑制作用

2.2 各種材料對體內腫瘤的抑制作用 SWNT、THP和SWNT－THP體內腫瘤抑制率率分別為（7.42±1.85）%，（52.46±2.41）%和（96.85±0.85）%。組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 THP緩釋效應研究結果 SWNT－THP和THP灌注后，大鼠尿液中THP濃度變化曲線見圖2。在灌注1 h后THP灌注大鼠尿液中幾乎不能夠檢測到THP。

圖2 THP在尿液中釋放曲線圖

2.4 不良反應觀察結果 在THP灌注的15只大鼠中，12只出現尿頻，7只出現血尿。在SWNT－THP灌注大鼠中沒有出現尿頻或者血尿。兩組大鼠在實驗前后肝、腎功能檢查未發現明顯的變化。

3 討 論

THP是中國泌尿外科常用的一種膀胱內化療藥物，但是由于其溶解度較低，部分患者不能夠耐受其不良反應，因此其在臨床的應用受到極大的限制。如何提高其治療作用以及降低其不良反應成為亟待解決的難題。國外一項針對絲裂霉素C的三期臨床研究認為提高藥物的靶向輸送可有效提高其對表淺性膀胱腫瘤的治療效果[2]。因此，新型的針對膀胱灌注化療的藥物載體的研究為解決該問題提供了一個思路。

SWNT由于其超大的比表面積以及在組織滲透性和組織存留方面的特點成為一種新型的腫瘤靶向的藥物載體[3－4]。目前的研究認為納米活性炭可將大量的生物活性分子，包括藥物、多肽、DNA等輸送至細胞內[5－8]；其進入細胞的方式包括胞吞以及自由擴散[9]；血液中的單壁納米碳管可通過膽道系統自糞便中排泄出體外[10]；同時研究還認為長期的納米暴露對機體不會造成傷害[11]。因此，本研究選擇SWNT－THP復合物膀胱灌注，同時觀察其對BIU－87細胞的抑制效應及對大鼠原位膀胱癌的治療效果及不良反應。

本研究結果顯示，SWNT－THP復合物能夠有效抑制BIU－87細胞增殖；同時在體內能有效地引起膀胱癌組織壞死，而不會引起正常組織的壞死；且無明顯不良反應。SWNT－THP復合物能夠有效抑制BIU－87細胞增殖的原因在于：SWNT有效地提高了THP的溶解度。在本研究中作者將SWNT與磷酸支鏈乙二醇反應，運用化學加成的方法將磷酸支鏈（PEG）結合在單壁納米碳管上，其次運用琥珀酰酐將一個羧基連接在THP分子上，將活化的THP分子與SWNT－PEG作用。通過一個可斷裂的鍵將吡柔比星以及單壁納米碳管結合在一起。因此，可有效地增強吡柔比星的水溶性。使藥物能夠達到對腫瘤細胞發揮殺傷作用的濃度。

除水溶性增強外，SWNT能夠特異性殺傷對腫瘤組織，可能與SWNT的緩釋性及能夠穿過腫瘤組織破壞血管有關。前期研究發現在血液中，以SWNT為載體的藥物承載系統能夠緩慢的釋放藥物[12－14]。本研究也發現負載在SWNT上面的THP能夠緩慢的釋放。甚至在大鼠首次排尿4 h后，還能夠檢測到THP分子；而單純用THP灌胃，在大鼠第1次排尿后幾乎不能夠檢測到THP在膀胱內存在。SWNT－THP復合物的緩釋性保證了THP與腫瘤細胞的充分接觸，因此，可增強THP的腫瘤組織殺作用。SWNT可以使得淋巴細胞在腫瘤組織聚集，且能夠增強淋巴細胞功能，而SWNT可被內皮細胞吞噬系統吸收。因此，腫瘤組織對SWNT的吸收增強，同時由于腫瘤組織內存在大量的生物活性物質，使非共價結合的SWNT－THP復合物在與腫瘤接觸后能夠迅速水解，從而特異性殺傷腫瘤組織。

THP用于膀胱灌注主要的不良反應有尿痛，尿頻，尿急，血尿和腎臟毒性等[15]。在本研究中，SWNT－THP復合物灌注大鼠沒有出現尿痛、尿頻、尿急、血尿和肝、腎臟毒性等不良反應。

總之，SWNT顯示了較好的膀胱內灌注化療的應用前景，擁有PEG尾的單壁納米碳管能夠有效改善化療藥物的水溶性；其次，SWNT能夠增強腫瘤組織對于化療藥物的吸收，這種吸收具有一定的特異性；再次，SWNT對于組織基本沒有毒性。本研究報道了SWNT再膀胱內灌注化療中的應用，這將為膀胱癌的治療提供一種新的生物材料選擇，促進膀胱腫瘤的治療研究。

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