腘窩淋巴結試驗模型的構建及在清開靈注射液致敏性研究中的應用

王 宏，劉兆華，杜 武，劉兆平

(山東大學藥學院1.藥理學系，2.新藥評價中心藥學實驗室，山東濟南 250012)

清開靈注射液(Qingkailing Injection，QKLI)是由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍根、黃芩苷和金銀花制成的中藥復方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡和醒神開竅之功效，用于熱病、神昏、中風偏癱和神志不清，也可用于急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦血栓和腦出血等的治療。隨著QKLI臨床應用的日益廣泛，不良反應尤其是過敏反應的報道日益增多［1－2］，嚴重阻礙了其生產和應用。確定致敏原、明確致敏機制是提高QKLI臨床用藥安全性的有效方法。QKLI成分復雜，其中含有的許多小分子物質如綠原酸、黃芩苷和一些相對分子質量較小的結合型氨基酸等均為可疑的致敏物質［3－5］。大量實驗表明，傳統的過敏反應檢測方法如主動全身過敏試驗、主動皮膚過敏試驗和被動皮膚過敏試驗等對大分子蛋白類物質的檢測結果與臨床有較好的一致性，而對小分子物質易產生假陰性結果［6］。因此，迫切需要新的實驗方法對QKLI的致敏性進行研究。

腘窩淋巴結試驗 (popliteal lymph node assay，PLNA)是近年來文獻報道較多的可用于小分子物質致敏性檢測的實驗方法［7－8］，對多個已知的對人體具有免疫刺激作用的化合物的研究顯示，PLNA實驗結果與臨床不良反應發生率之間具有較高的相關性［9］。鹽酸 D-青霉胺(D-penicillamine hydrochloride，D-Pen)是臨床不良反應發生率較高的一種小分子物質，國外研究者多用其作為PLNA建模的陽性藥物［10－11］，本研究以 D-Pen為陽性對照藥，以苯巴比妥(phenobarbital，PB)為陰性對照藥，通過對D-Pen量效關系和腘窩淋巴結(popliteal lymph node，PLN)時效的研究，選擇D-pen的最低有效劑量和最佳解剖時間，復制直接法 PLNA(direct PLNA，d-PLNA)和間接法 PLNA(secondary PLNA，s-PLNA)模型，并檢測QKLI的致敏性。通過比較小鼠給藥側和未給藥側PLN的反應情況，推測QKLI的致敏可能性。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級BALB/c小鼠，雌性，7～8周齡，體質量18～22 g，由山東大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(魯)20090001。小鼠預飼養1周后開始實驗。自由飲水攝食，溫度21～23℃，相對濕度45% ～55%，12 h明/12 h暗。

1.2 藥物、試劑和儀器

D-Pen，美國MP Biomedicals公司，用生理鹽水溶解，用前過濾除菌;PB，美國Internal Laboratory公司，批號2300605，用20%DMSO+80%生理鹽水溶解;QKLI，每支2 ml，河北神威藥業有限公司，批號10062652;磷酸鹽緩沖液(PBS)，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，新西蘭Gibco公司;DMSO，細胞培養級，美國Solarbio公司。CytoreconTMCYT-1000細胞計數儀，美國Effector Cell Institute公司;ME235P型分析天平，德國賽多利斯公司;Eppendorf Minispin離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 清開靈注射液的制備

由于清開靈粉針劑已經停產，為了制得較高濃度的QKLI，將市售 QKLI進行凍干，方法如下:將QKLI轉移至西林瓶后，在－80℃冰箱放置24 h，隨即采用冷凍干燥法，獲得凍干粉，然后用適量注射用水溶解，制備2倍和4倍原液濃度的QKLI。

1.4 D-Pen量效關系和PLN反應動力學測定

小鼠隨機分為正常對照、D-Pen 12.5，25.0，37.5，50.0 和 62.5 mg·kg－1和 PB 50 mg·kg－1組，每組10只。將配置好的D-Pen和PB過濾除菌，一次性sc給予小鼠右側后肢足趾部，進針方向由足跟指向足尖，給藥體積均為每只50μl;左側不做任何處理。正常對照組sc給予生理鹽水。分別于給藥后第5，7和9天處死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，入無菌操作間，分離并摘取左、右兩側PLN，剔除周圍脂肪和結締組織，然后迅速放入冰浴的含1%FBS的PBS(1%FBS-PBS)中，取出稱質量，計算PLN質量指數(mass index，MI)，MI=PLN 質量(處理側)(mg)/PLN質量(未處理側)(mg)。將每側淋巴結分別放在200目不銹鋼網上，用小杵輕輕研磨的同時用冰浴的1%FBS-PBS沖洗至小培養皿中，收集細胞懸液，310×g離心5 min，棄上清，洗滌1次，將細胞重懸于0.5 ml冰浴的1%FBS-PBS中，采用細胞計數儀計細胞數，計算PLN的細胞指數(cell index，CI)，CI=PLN(處理側)細胞數/PLN(未處理側)細胞數。根據實驗結果選擇D-Pen的最低有效劑量和最佳解剖時間，為采用d-PLNA和s-PLNA進行藥物檢測時給藥劑量和解剖時間的選擇提供實驗依據。

1.5 直接腘窩淋巴結試驗檢測清開靈注射液的致敏性

小鼠隨機分為正常對照組、D-Pen 37.5 mg·kg－1組、PB 50.0 mg·kg－1組、QKLI原液、2 倍和4 倍原液濃度組，每組10只。分別在小鼠右側后肢足趾部一次性sc 50μl上述藥物，左側不做任何處理。正常對照組給予生理鹽水。給藥后第7天，處死小鼠，按1.4方法解剖，取PLN，稱重，研磨，制備單細胞懸液，計算MI和CI。

1.6 間接腘窩淋巴結試驗檢測清開靈注射液的致敏性

小鼠隨機分為正常對照組、D-Pen 37.5 mg·kg－1組、PB 50 mg·kg－1組、2 倍和 4 倍 QKLI原液濃度組，小鼠右側后肢足趾部一次性sc給予50μl上述藥物，左側不做任何處理。2個月后，同一小鼠的同側足趾 sc 給予 D-Pen 25 mg·kg－1，PB 25 mg·kg－1，2倍和4倍QKLI原液濃度組注射QKLI原液進行激發，正常對照組sc給予生理鹽水。激發后第7天處死小鼠，按1.4方法解剖，取PLN，稱重，研磨，制備單細胞懸液，計算MI和CI。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 D-Pen最低有效劑量和最佳解剖時間的選擇

由表1可見，單次足趾部sc給予D-Pen后第7天，D-Pen 37.5，50.0 和62.5 mg·kg－1組處理側 PLN質量和細胞計數均顯著高于未處理側(P＜0.05，P＜0.01)，MI和 CI顯著升高，達到陽性反應標準(平均 MI≥2，CI≥5)，且高于正常對照組(P ＜0.05，P ＜0.01)。D-Pen 25 mg·kg－1組處理側PLN質量和細胞計數較未處理側亦升高(P＜0.05)，但MI和 CI未達到陽性標準。上述結果提示，D-Pen 的最低有效劑量為 37.5 mg·kg－1。

PLN時效關系分析顯示(表2)，sc給予D-Pen 37.5 mg·kg－1后第 7 天，其 MI和 CI均達到陽性反應標準，而給藥后第5和9天MI和CI未達到陽性標準，提示最佳解剖時間為給藥后第7天。

Tab.1 Dose-dependent response of D-penicillamine hydrochloride(D-Pen)inducing popliteal lymph node(PLN)response

Tab.2 Time-dependent reaction of D-Pen hydrochloride in popliteal lymph node(PLN)

2.2 QKLI對d-PLNA小鼠PLN反應的影響

由表3 可見，與未處理側相比，PB 50 mg·kg－1組處理側PLN質量和細胞計數無顯著變化。D-Pen 37.5 mg·kg－1組、2 倍和4 倍 QKLI原液濃度組處理側PLN質量和細胞計數均顯著高于未處理側(P＜0.01)，與正常對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)，MI和CI顯著升高，達到陽性反應標準;QKLI原液組(QKLI×1)處理側PLN的質量和細胞計數較未處理側亦升高(P ＜0.05)，且高于正常對照組(P ＜0.05，P ＜0.01)，但MI和CI未達到陽性反應標準。

2.3 QKLI對s-PLNA小鼠PLN反應的影響

由表4可見，足趾部sc低于有效劑量的藥物進行激發后，PB組處理側PLN質量和細胞計數與未處理側相比無顯著變化，與正常對照組相比，亦無統計學意義。D-Pen組、2倍和4倍QKLI原液濃度組處理側PLN質量和細胞計數均顯著高于未處理側(P ＜0.01)，且高于正常對照組(P ＜0.01)，MI和CI達到陽性反應判定標準。

Tab.3 Effect of Qingkailing injection(QKLI)on PLN response of mice in direct popliteal lymph node assay

Tab.4 Effect of QKLI on PLN response of mice in secondary popliteal lymph node assay

3 討論

PLNA是一種較為可靠的檢測注射用小分子藥物致敏性的實驗方法，其發生機制可能與危險假說和半抗原假說有關，即小分子化合物可能通過提供危險信號或作為半抗原的方式激活機體的免疫系統，進而刺激機體產生免疫應答。小鼠足趾部sc給藥后，通過檢測局部引流PLN的MI和CI的變化情況，可以推測受試物的致敏潛能。

d-PLNA是將受試物直接注入小鼠后肢足趾部皮下，操作簡單，靈敏度高，實驗結果重復性好，且能進行量效關系研究，是評價小分子化合物免疫刺激潛能的較為理想的實驗方法，但是不能區分受試物引起的陽性反應是由免疫系統介導的過敏反應還是由刺激性因素引起的炎癥反應［13－15］。s-PLNA是用有效劑量的受試物致敏小鼠，一段時間(數周至數月)后，當處理側的PLN與未處理側相比無顯著性差異后，再用低于有效劑量的同一受試物進行激發，若受試物能夠誘導T細胞介導的免疫反應，則激發后能引起處理側PLN中淋巴細胞的活化與增殖，進而引起PLN質量和細胞數目的增多，達到陽性反應的標準［16－17］;若受試物的作用僅為刺激性因素引起的炎癥反應，則用激發劑量的藥量激發后不能引起PLN陽性反應。因此，s-PLNA能夠克服d-PLNA不能研究反應機制的不足。本研究將d-PLNA和s-PLNA聯合應用進行QKLI致敏性檢測。

通過對陽性對照藥D-Pen量效關系和PLN反應動力學研究，本研究確定了D-Pen的最低有效劑量為37.5 mg·kg－1，最佳解剖時間為藥后第7 天，為d-PLNA陽性藥物給藥劑量與解剖時間的選擇和s-PLNA給藥劑量及激發劑量與解剖時間的選擇提供了實驗依據。

d-PLNA實驗結果顯示，2倍和4倍原液濃度的QKLI可誘導BALB/c小鼠發生明顯的PLN反應，表現為MI和CI明顯升高，且達到陽性反應的標準，提示QKLI具有一定的致敏潛能。為了進一步研究其具體機制，本研究應用s-PLNA對2倍和4倍原液濃度的QKLI進行檢測。首次致敏2個月后，用不能引起PLNA陽性反應的QKLI原液進行激發，激發后第7天解剖，MI和CI均達到了陽性反應的標準，表明較高濃度的QKLI能夠誘導T細胞介導的免疫反應。上述實驗結果提示，QKLI中可能存在某些小分子致敏性成分，這些成分達到一定的濃度時能夠誘導機體發生過敏反應。但是，QKLI成分復雜，具體引發過敏反應的小分子成分尚不清楚，有待今后進一步研究。

中藥注射劑的安全性問題是制約其應用與發展的瓶頸，PLNA為中藥注射劑小分子致敏原的篩選提供了有效途徑，具有較好的應用價值。

［1］Wang QW， Li D， Feng ZH. Adverse drug reactions induced by Qingkailing injection:an analysis of 287 cases［J］.Eval Anal Drug-Use in Hosp China(中國醫院用藥評價與分析)，2010，10(7):652-654.

［2］Yu DH， Li B， Cheng M. Analysis of 34 cases with adverse drug reactions of Qingkailing Injection［J］.China Licensed Pharmacist(中國執業藥師)，2010，7(12):6-8.

［3］Liu YP. Adverse reactions of traditional Chinese medicines in 111 cases［J］.Adverse Drug Reactions J(藥物不良反應雜志)，2000，2(2):94-97.

［4］He Z，Qu HH，Wang XQ，ZhaoY，Li YF，Hu LN，et al.Allergenicity of chlorogenic acid as hapten［J］.J Beijing Univ Tradit Chin Med(北京中醫藥大學學報)，2010，33(10):667-669，680.

［5］Tong L.The relationship of adverse reactions of Shuanghuanglian Injection with its components［J］，Chin Tradit Pat Med(中成藥)，1997，19(4):47－48.

［6］Choquet-Kastylevsky G， Descotes J. Value of animal models for predicting hypersensitivity reactions to medicinal products［J］.Toxicology，1998，129(1):27-35.

［7］L?vik M，Alberg T，Nygaard UC，Samuelsen M，Groeng EC，Gaarder PI.Popliteal lymph node(PLN)assay to study adjuvant effects on respiratory allergy［J］.Methods，2007，41(1):72-79.

［8］Shinkai K，Nakamura K，Tsutsui N，Kuninishi Y，Iwaki Y，Nishida H，et al.Mouse popliteal lymph node assay for assessment of allergic and autoimmunity-inducing potentials of low-molecular-weight drugs［J］.J Toxicol Sci，1999，24(2):95-102.

［9］Pieters R.The popliteal lymph node assay:a tool for predicting drug allergies［J］.Toxicology，2001，158(1-2):65-69.

［10］Aida T，Kimura T，Ishikawa N，Shinkai K.Evaluation of allergenic potential of low-molecular compounds by mouse popliteal lymph node assay［J］.J Toxicol Sci，1998，23(5):425-432.

［11］Nierkens S，Aalbers M，Bleumink R，Boon L，Pieters R.Drug-induced type 1 and type 2 immune responses are characterized by distinct profiles of cell kinetics，cytokine production，and expression of co-stimulatory molecules in the popliteal lymph node assay［J］.J Immunotoxicol，2005，2(3):141-150.

［12］Ravel G，Descotes J.Popliteal lymph node assay:facts and perspectives［J］.J Appl Toxicol，2005，25(6):451-458.

［13］Gutting BW，Schomaker SJ，Kaplan AH，Amacher DE.A comparison of the direct and reporter antigen popliteal lymph node assay for the detection of immunomodulation by low molecular weight compounds［J］.Toxicol Sci，1999，51(1):71-79.

［14］Choquet-Kastylevsky G， Descotes J. Popliteal lymph node responses to acetone and ethanol differ from those induced by streptozotocin［J］.Arch Toxicol，2004，78(11):649-654.

［15］Ravel G，Christ M，Horand F，Descotes J.Cytokine release does not improve the sensitivity and specificity of the direct popliteal lymph node assay［J］.Toxicology，2004，200(2-3):247-254.

［16］Friedrich K，Delgado IF，Santos LM，Paumgartten FJ.Assessment of sensitization potential of monoterpenes using the rat popliteal lymph node assay［J］.Food Chem Toxicol，2007，45(8):1516-1522.

［17］Liu ZH， Liu ZP， Zhou GY. Application of popliteal lymph node assay in study of drug hypersensitivity［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2009，23(1):70-75.