廣西莪術(shù)及其莖葉多糖的體外纖溶活性研究

曾金強(qiáng) 潘小姣 陳秋燕 唐璐

1．廣西邊防總隊(duì)醫(yī)院，廣西南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001

廣西莪術(shù)及其莖葉多糖的體外纖溶活性研究

曾金強(qiáng)1潘小姣2陳秋燕2唐璐2

1．廣西邊防總隊(duì)醫(yī)院，廣西南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001

目的考察廣西莪術(shù)及其莖葉多糖的體外纖溶活性。方法用分步沉淀法，分離廣西莪術(shù)及其莖葉的多糖，然后用纖維蛋白瓊脂平板法考察不同醇沉多糖的纖溶活性。結(jié)果廣西莪術(shù)只有10%醇濃度沉淀多糖的體外纖溶效果穩(wěn)定。廣西莪術(shù)莖葉10%～30%的醇濃度沉淀多糖體外纖溶作用穩(wěn)定，40%～60%的醇濃度沉淀多糖在高、中濃度時(shí)作用穩(wěn)定，在低濃度時(shí)作用不穩(wěn)定；在有纖溶活性的分步沉淀多糖中，除了10%和30%的醇濃度沉淀多糖具有濃度依賴性之外（P＜0.05），其余纖溶活性多糖均無(wú)濃度依賴性。結(jié)論廣西莪術(shù)及其莖葉的多糖成分具有體外纖溶活性。

廣西莪術(shù)；纖溶活性；多糖

莪術(shù)為姜科姜黃屬植物蓬莪術(shù)Curcum a phaeocaulis Val.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，其性味辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具行氣破血、消積止痛的功效，用于癥瘕痞塊，瘀血經(jīng)閉，胸痹心痛，食積脹痛[1]。其中的廣西莪術(shù)主要分布于我國(guó)的廣西壯族自治區(qū)，又稱毛莪術(shù)、桂莪術(shù)，主要含有揮發(fā)油、姜黃素、二苯庚烷類(lèi)、多種萜類(lèi)及多糖類(lèi)等成分[2-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，莪術(shù)具有抗腫瘤、抗菌、抗血栓等廣泛的藥理活性，但是目前大多數(shù)研究對(duì)象都是局限于莪術(shù)的醇、水提取液或者揮發(fā)油[4-6]，對(duì)莪術(shù)多糖的藥理研究較少，目前尚無(wú)莪術(shù)多糖纖溶方面的研究報(bào)道。莪術(shù)莖葉一般被認(rèn)為不具有藥用價(jià)值，目前尚無(wú)藥效方面的研究報(bào)道。筆者在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)桂郁金（來(lái)源為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F. Liang干燥的塊根）多糖具有明顯的體外纖溶作用，廣西莪術(shù)及其莖葉和桂郁金來(lái)源于相同植物的不同部位，故推測(cè)廣西莪術(shù)及其莖葉也可能具有纖溶活性的多糖。本文采用纖維蛋白瓊脂平板法，對(duì)廣西莪術(shù)及其莖葉的多糖進(jìn)行體外纖溶活性研究，現(xiàn)將研究報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 藥材

廣西莪術(shù)（生品陰干）及其莖葉（干燥地上部位），均產(chǎn)自廣西靈山，兩者經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧副教授鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F. Liang的根莖及其莖葉。

1.2 試劑

瓊脂（上海國(guó)藥集團(tuán)），尿激酶（純度：85%，批號(hào)：39784，Aladdin Chemistry Co.Ltd），纖維蛋白原（純度：75%，批號(hào)：029K7636V，Sigma，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司分裝），凝血酶（純度：75%，批號(hào)：070M7351V，Sigma，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司分裝），磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4，博海生物科技有限公司），乙醇為分析純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

移液槍?zhuān)―ragon-med），90 mm玻璃培養(yǎng)皿（上海申玻儀器公司），游標(biāo)卡尺（上海恒勝工具有限公司），B3500S-MT超聲清洗儀（上海必能信超聲有限公司），LRH-100生物培養(yǎng)箱（廣東泰宏醫(yī)療器械有限公司），80-2醫(yī)用離心機(jī)（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

表1 廣西莪術(shù)分步沉淀多糖的體外纖溶活性結(jié)果（n=3）

2 方法與結(jié)果

2.1 分步醇沉法提取分離廣西莪術(shù)及其莖葉的多糖

取廣西莪術(shù)和其莖葉粉末各5 g，分別加50mL和80mL純水，超聲提取1 h，過(guò)濾，將濾液分別水浴濃縮至12 mL，取2mL濃縮液繼續(xù)水浴蒸干得到水提液浸膏，剩下10 mL濃縮液分別加入適量無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)含醇量為10%，置冰箱5℃冷藏至少5 h以上，離心5min（10 000 r/min），分取多糖沉淀和上清液，多糖沉淀于45℃低溫干燥之后置冰箱冷凍保存，剩下的上清液再加入適量無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)含醇量為20%，同法制備20%的醇沉多糖，然后依次同法制備得到30%～90%的醇沉多糖。將90%醇沉多糖的乙醇上清液水浴蒸干，得到上清夜浸膏。將水提液浸膏、各段醇沉多糖和乙醇上清液分別加水制成濃度為24、12和6mg/mL三個(gè)濃度的樣品，備用。

表2 廣西莪術(shù)莖葉分段沉淀多糖的體外纖溶活性結(jié)果（±s，n=3）

表2 廣西莪術(shù)莖葉分段沉淀多糖的體外纖溶活性結(jié)果（±s，n=3）

注：“±”表示纖溶作用不穩(wěn)定，時(shí)有時(shí)無(wú)；“－”表示沒(méi)有纖溶作用；“★”表示該組樣品不同濃度之間的纖溶活性差異顯著，P＜0.05；“*”表示由于2 mL提取液的浸膏重0.271 2 g，故推算出12mL提取液的浸膏重1.627 2 g，進(jìn)而推算出5 g莪術(shù)的浸膏提取率約為32.54%

樣品重量（mg）得率（%）濃度（mg/mL）加樣量（μL）透明圈直徑（±s，mm）莖葉超聲水提液★1 627.2 32.54莖葉10%醇沉多糖★16.75.76莖葉20%醇沉多糖8.73.00莖葉30%醇沉多糖★8.83.04莖葉40%醇沉多糖21.17.28莖葉50%醇沉多糖34.411.87莖葉60%醇沉多糖31.610.91 23.05±1.93 20.87±1.80 18.25±2.33 21.08±2.68 19.27±2.02 17.07±2.54 20.66±4.37 16.71±2.18 16.65±5.18 20.30±6.15 19.22±4.67 15.79±3.20 19.72±5.59 19.57±4.63 ± 18.15±3.76 18.30±4.59 ± 16.66±3.75 17.65±3.89莖葉70%醇沉多糖26.79.22莖葉80%醇沉多糖34.912.05莖葉90%醇沉多糖14.85.11 90%乙醇上清液92.031.76 ±±±±－－－－－－－－－尿激酶★24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 24.00 12.00 6.00 100.00 U/mL 50.00 U/mL 25.00 U/mL 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 14.85±0.97 13.71±0.77 12.57±0.86

2.2 儲(chǔ)備溶液的配置

用PBS緩沖溶液分別配制10 mg/mL的纖維蛋白原溶液、1 U/mL的凝血酶和100 U/mL的尿激酶，小劑量分裝后于-20℃保存，臨用前取出適量解凍后使用。

2.3 每個(gè)纖維蛋白瓊脂平板的制備

取0.2 g瓊脂加適量PBS緩沖液加熱溶解，最后用PBS緩沖液定容成20mL。待溫度降到55～60℃時(shí)，取18mL放入玻璃杯中，先加入解凍至30℃的纖維蛋白原溶液（10mg/mL） 1 mL，搖勻之后再加入解凍至30℃的凝血酶溶液（1 U/mL）1 mL，搖勻，立即倒入水平放置的90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，待冷凝之后打孔。

2.4 樣品的加入和結(jié)果的測(cè)量

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣西莪術(shù)只有10%醇濃度沉淀多糖的體外纖溶效果穩(wěn)定。廣西莪術(shù)莖葉10%～30%的醇濃度沉淀多糖體外纖溶作用穩(wěn)定，40%～60%的醇濃度沉淀多糖在高、中濃度時(shí)作用穩(wěn)定，在低濃度時(shí)作用不穩(wěn)定；在有纖溶活性的分步沉淀多糖中，除了10%和30%的醇濃度沉淀多糖具有濃度依賴性之外（P＜0.05），其余纖溶活性多糖的均無(wú)濃度依賴性。見(jiàn)表1、2。

3 討論

纖維蛋白平板法是目前最常用的溶栓活性體外檢測(cè)方法，其實(shí)驗(yàn)原理為：纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)化成纖維蛋白（形成血栓的主要結(jié)構(gòu)），而當(dāng)藥物將纖維蛋白溶解，就會(huì)產(chǎn)生纖溶圈，通過(guò)產(chǎn)生纖溶圈的大小可以推斷藥物具有纖溶活性能力的大小[7]。纖維蛋白原、凝血酶和尿激酶的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，配成溶液之后最好小劑量分裝冷凍保存，每次根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需取出適量解凍，如果反復(fù)地凍溶將使其失去活性。

用分步醇沉的方法分離多糖時(shí)，不同濃度醇沉多糖的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）分布不同[8]。10%～30%醇濃度沉淀出的應(yīng)是一些高M(jìn)r的多糖，40%～60%醇濃度沉淀出的應(yīng)是一些中等Mr的多糖，70%～90%醇濃度沉淀出的應(yīng)是一些低Mr的多糖。廣西莪術(shù)只有10%醇沉多糖具有穩(wěn)定的體外纖溶活性，故推測(cè)其具有活性的應(yīng)該是一些高M(jìn)r的多糖，但是通過(guò)碘液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該活性多糖中含有大量淀粉，所以雖然該段多糖的得率較高（24.70%），但是因?yàn)槠浜胁痪咚幮У母進(jìn)r多糖（淀粉），所以其真正的纖溶活性多糖的含量應(yīng)該不高。廣西莪術(shù)莖葉10%～60%的醇沉多糖都有較明顯的體外纖溶活性，該部分醇沉多糖的得率較高，合計(jì)約為40%，且通過(guò)用碘液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其所有的活性多糖均不含淀粉。由此可見(jiàn)，廣西莪術(shù)莖葉中含有較多的高至中等Mr的體外纖溶活性多糖，而且不含淀粉，可以在用醇沉的方法分離多糖的過(guò)程中避免淀粉的干擾，因此廣西莪術(shù)莖葉在抗血栓方面更具有開(kāi)發(fā)的潛在價(jià)值。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：257-258.

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Vitro fibrinolytic activities of polysaccharides from Rhizome and stem and its leaf of Curcuma kwangsiensis

ZENG Jinqiang1 PAN Xiaojiao2 CHEN Qiuyan2 TANG Lu2
1.Guangxi Frontier Corps Hospital,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530022,China;2.University of Guangxi Traditional Chinese Medical,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530001,China

ObjectiveTo observe the vitro fibrinolytic activities of polysaccharides from Rhizome and its stem and leaf of Curcuma kwangsiensis.MethodsFractional precipitation was used to separate the different polysaccharides and fibrin plate method was used to detect their vitro fibrinolytic activities.ResultsOnly the 10%alcohol precipitated polysaccharides from Rhizome of Curcuma kwangsiensis had stable vitro fibrinolytic activities.The polysaccharides having stable vitro fibrinolytic activities from stem and leaf of Curcuma kwangsiensis were the 10%to 30%alcohol precipitated polysaccharides and the high and medium concetration of 40%to 60%alcohol precipitated polysaccharides.10%and 30%alcohol precipitated polysaccharides had vitro fibrinolytic activities in concentration-dependentmanner(P＜0.05).Other fibrinolytic activities polysaccharides had no concentra-tion-dependent.ConclusionPolysaccharides from rhizome,stem and leaf of Curcuma kwangsiensis has vitro fibrinolytic activities.

Curcuma kwangsiensis;Fibrinolytic activities;Polysaccharides

R972.5

A

1673-7210（2012）11（c）-0022-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：200810LX100）；2011年度廣西高等學(xué)校科研資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：200103YB081）。

曾金強(qiáng)（1972-），男，副主任醫(yī)師，主要從事活血化瘀中藥治療疼痛癥及心血管疾病的研究。

潘小姣（1975-），女，碩士研究生，副教授，主要從事中藥活性成分篩選及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

2012-07-20 本文編輯：衛(wèi)軻）