復方丹參注射液對大鼠急性脊髓損傷的保護作用

蘭鴻 陳鴻梅

湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部，湖北十堰 442000

復方丹參注射液對大鼠急性脊髓損傷的保護作用

蘭鴻 陳鴻梅▲

湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部，湖北十堰 442000

目的觀察復方丹參注射液對急性脊髓損傷大鼠的保護作用。方法采用改良Allen weight dropping（Allen WD）打擊法將42只Wistar大鼠制成脊髓中度損傷模型，分別給予復方丹參注射液、甲基強的松龍及生理鹽水治療，觀察動物不同時間的神經功能評分、斜板試驗及脊髓細胞凋亡率的變化。結果從傷后2周起，丹參組的神經功能評分和斜板最大角度分別與生理鹽水組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。從傷后12 h起，丹參組細胞凋亡率與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），丹參組與甲強龍組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論復方丹參注射液對大鼠脊髓損傷細胞凋亡具有保護作用，能夠達到治療急性脊髓損傷的作用。

丹參；急性脊髓損傷；大鼠；細胞凋亡

隨著交通業和建筑業的發展，臨床中急性脊髓損傷（acute spinal cord injury）逐漸增加。急性脊髓損傷具有較高的致殘率，研究表明急性脊髓損傷后二次脊髓打擊程度遠遠大于原發損傷[1]。臨床中如何避免繼發性脊髓二次打擊成為治療急性脊髓損傷的關鍵。雖然文獻中多有報道急性脊髓損傷后即刻大劑量甲強龍治療方法，但研究發現甲強龍雖能改善急性脊髓損傷發展結果，但有增加相關并發癥的可能。近年來有學者嘗試使用丹參治療急性脊髓損傷的報道。本文通過實驗初步探討丹參對急性脊髓損傷的神經保護作用。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠，42只，體重0.20～0.25 kg，雌雄不限，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（鄂）2005-0031。

丹參注射液（上海中西醫制藥有限公司）；甲基強的松龍琥珀酸鈉（美國Upjohn公司）；細胞凋亡檢檢測試劑盒（POD武漢博士德生物工程有限公司）；異氟烷和脂肪乳（黑龍江省集成醫藥實業有限公司）。

1.2 急性脊髓損傷模型制備

將42只Wistar大鼠隨機分為三組，每組14例：生理鹽水組、丹參組、甲強龍組。將把異氟烷和脂肪乳混合做成乳化異氟烷。制備方法：用30%脂肪乳為載體，室溫下（20℃）應用玻璃瓶法，配制8%乳化異氟烷，即將1.2 mL的液態異氟烷和21.3mL的30%脂肪乳加入至一個氣密性良好的25～30mL玻璃容器內，振蕩器上以2 000 r/min的速度劇烈震蕩30 s，靜置30 s，然后以2 000 r/min速度劇烈震蕩50 min，達到平衡后置于4℃冰箱中備用。后以0.51～0.64mL/kg腹腔注射，麻醉后采用改良Allen WD打擊法制備ASCI模型。剔除大鼠背部正中毛發，選擇后正中切口顯露T8-T10椎板，切除椎板過程中注意保護硬脊膜完整性。將預備的銅片制成曲度直徑與椎管相似圓形墊片，將墊片放置于硬脊膜表面。將兩頭相通的玻璃試管垂直放置與顯露創面上方，選擇重7.5 g銅錘從高10 cm處通過玻璃試管自由下落，打擊墊片，造成急性脊髓損傷模型，關閉手術切口。術后采用人工擠壓膀胱方法輔助排尿，每日6次。

1.3 給藥方法

大鼠造成急性脊髓損傷后，復方丹參注射液1.08mg/kg體重，給予腹腔注射，每日1次，共連續注射7 d；甲強龍15min內按照30mg/kg給予腹腔注射，傷后1 h開始，以5.4mg/（kg·h）腹腔注射，共23 h，平均分4次使用。生理鹽水組傷后按照丹參組方法腹腔注射生理鹽水。

1.4 細胞凋亡檢測

隨機取4只大鼠，于造模后24 h、2、4、6周，開胸經心臟先以生理鹽水灌注，觀察液體變清后，以5%多聚甲醛磷酸液行脊髓灌注，脊髓固定后，通過原切口顯露脊髓并切取損傷階段約5mm，再次以5%多聚甲醛磷酸液浸泡24 h，采用脫水石蠟常規包埋，連續切取厚度5μm切片10張，隨機選取4張切片放入細胞凋亡檢測試劑盒檢測，凋亡細胞核顯微鏡下觀察呈黃色。經計算機分析處理系分別檢測出每張切片凋亡細胞數和總細胞數，以凋亡細胞數/總細胞數計算凋亡指數。

1.5 觀察指標

分別于術后2、4、6周測量大鼠斜板試驗度數和大鼠運動功能評分（BBB評分）。斜板試驗[2]：將斜板與大鼠長軸呈垂直放置，緩慢抬高斜板，每次抬高5°，觀察大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大度數，反復測量3次，取平均值，計算大鼠斜板試驗功能值。BBB評分以Basso等[3]描述的方法為準，采用盲法原則，有其他人員觀察測量。

1.6 統計學方法

采用統計軟件SPSS 16.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡檢測結果

結果顯示，丹參組和甲強龍組細胞凋亡指數均低于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。丹參組與甲強龍組細胞凋亡指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 細胞凋亡檢測結果（±s）

表1 細胞凋亡檢測結果（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數凋亡指數24 h 2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強龍組444 47.38±4.07 31.45±3.09* 30.94±3.56* 39.41±3.35 24.59±3.18* 25.28±3.41* 31.84±3.62 14.76±3.27* 13.34±3.54* 27.59±3.37 7.46±3.36* 8.23±3.40*

2.2 斜板試驗結果

結果顯示，丹參組和甲強龍組大鼠斜板試驗功能值均高于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 斜板試驗比較（±s，°）

表2 斜板試驗比較（±s，°）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數最大斜板試驗度數2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強龍組10 10 10 19.48±6.56 28.56±5.79* 29.28±5.43* 28.57±5.82 44.68±5.19* 46.78±5.15* 35.75±6.23 54.26±5.42* 55.91±5.84*

2.3 BBB評分結果

結果顯示，丹參組和甲強龍組大鼠運動功能評分（BBB評分）均高于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

研究表明急性脊髓損傷后脊髓受到雙重打擊，首先如外傷導致直接的脊髓壓迫，致使壓迫部位出血、壞死；其次壓迫后若不能及時解除壓迫脊髓出現、缺血水腫，局部吞噬細胞、組織因子等炎癥介質滲出，缺血等因素激活谷氨酸受體，致具有細胞毒性物質溢出，使脊髓遭受二次打擊，引起細胞凋亡。二次脊髓打擊是持續過程，且其過程是可逆的，若臨床中能夠及時阻斷脊髓二次打擊，可有效阻止神經細胞凋亡和功能退變，保護神經細胞，促進神經細胞和軸突生長，有助于脊髓功能恢復。

表3 BBB評分比較（±s，分）

表3 BBB評分比較（±s，分）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別只數BBB評分2周4周6周生理鹽水組丹參組甲強龍組10 10 10 5.84±0.63 7.16±0.97* 7.78±0.85* 8.07±1.41 12.86±1.24* 13.46±1.57* 9.15±1.67 13.76±1.35* 14.19±1.48*

丹參有效成分為丹參酮，研究表明丹參酮可抑制炎癥一期反應中組織胺對毛細血管的作用，降低毛細血管通透性，同時可以抑制二期炎癥反應中白細胞通過毛細血管向組織游走，達到抑制炎癥反應。最近研究表明核因子-κB（NF-κB）通過逆轉錄參與多核細胞的炎癥反應，在炎癥反應中起到重要作用[4]，汪吉明等[5]研究表明急性創傷性脊髓損傷后，復方丹參可以抑制NF-κB的活性表達，對減輕NF-κB介導的炎癥反應，降低炎癥介質對脊髓神經細胞的毒性作用。急性脊髓損傷后數小時內可激發血液系統的凝血功能，血液處于高凝狀態[6]，丹參酮可擴張微循環，增加受損部位神經細胞血供，減緩或抑制細胞凋亡。余永桂等[7]將急性脊髓損傷模型分為丹參治療組和生理鹽水治療組，結果顯示丹參組細胞凋亡數低于生理鹽水治療組，丹參組bcl-2表達增高，他們認為丹參可能通過“抑制氧自由基脂質過氧化、減少細胞鈣內流、調節細胞因子和上調bcl-2”的作用達到抑制細胞凋亡的作用。本研究中細胞凋亡檢測表明丹參組術后24 h、2、4、6周細胞凋亡指數分別為（31.45±3.09）、（24.59±3.18）、（14.76±3.27）和（7.46±3.36），低于生理鹽水治療組，差異有統計學意義（P＜0.05），且丹參組細胞凋亡指數降低速度大于生理鹽水治療組，說明丹參對急性脊髓損傷具有治療作用。試驗結果顯示丹參組大鼠BBB評分和斜板試驗均高于生理鹽水治療組，差異有統計學意義（P＜0.05），筆者認為丹參通過抑制急性脊髓損傷后炎癥反應和擴張局部微循環達到抑制細胞凋亡，治療急性脊髓損傷的作用。臨床觀察表明經丹參治療患者全血黏度切變值、纖維蛋白原、紅細胞聚集指數及紅細胞變形指數均有明顯改善，說明丹參可改善急性脊髓損傷患者末循環，起到保護ASCI的作用。

目前臨床中多使用大劑量甲基強的松龍琥珀酸鈉沖擊治療急性脊髓損傷，研究顯示甲強龍可減輕急性脊髓損傷后脊髓水腫、炎癥反應等繼發脊髓損傷，達到治療作用。本研究中發現丹參治療組大鼠細胞凋亡指數、BBB評分和斜板試驗與甲強龍組相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明丹參對脊髓繼發損傷的治療作用與甲強龍相似。文獻報道大劑量甲強龍沖擊治療可引起較多并發癥，限制了甲強龍的應用。故筆者認為丹參可替代甲強龍用于治療急性脊髓損傷。

本實驗為丹參應用治療急性脊髓損傷提供了理論依據，但本研究未涉及分子機制，以后研究中有待于對丹參治療急性脊髓損傷的分子機制做進一步探討。

[1]Beulter B.Toll-like receptor：how they work and what they do[J].Curr Opin Hematol，2002，（9）：2.

[2]楊挺，蔣贊利，茅祖斌.血塞通聯合復方丹參注射液對大鼠急性脊髓損傷的治療作用及其機制的初步研究[J].現代醫藥，2010，38（2）：129-132.

[3]Basso DM，Beattiem S，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale foropen-field testing in rats[J].J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

[4]叢斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用[J].中國病理生理雜志，2000，16（10）：991.

[5]汪吉明，孔抗美，齊偉力，等.復方丹參對大鼠急性脊髓損傷后核因子-κB活性的影響[J].中國骨與關節損傷，2007，22（4）：307-309.

[6]許健強，張慶俊.脊髓損傷后的高凝狀態[J].中國脊柱脊髓雜志，2002，12（6）：422-423

[7]余永桂，張功禮，施永彥，等.丹參注射液椎管內局部灌注對急性脊髓損傷的保護作用[J].中華試驗外科雜志，2004，21（8）：993-994.

Protective affect of Com pound Danshen Injection for rats w ith acute spinal cord injury

LAN Hong CHEN Hongmei▲
Departmentof Pharmacy,Taihe Hospital Affiliated to HubeiUniversity ofMedicine,HubeiProvince,Shiyan 442000,China

ObjectiveTo observe the protective affect of Compound Danshen Injection for rats with acute spinal cord injury.MethodsThe ratswere established themodel ofmoderate spinal cord injury by amodification of Allen weight dropping(Allen WD)method and treated with Compound Danshen Injection,Methylprednisolone and physiological saline,respectively,as treatment.Neurological functions were evaluated by using Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores,and the angle of clivus test and cell apoptosiswere performed at 12 h after injury.ResultsThere were significant differences(all P＜0.05)in BBB scores and angle of clivus test between Danshen group and control group from the second week.There were significant differences(P＜0.05)in cell apoptosis between Danshen group and control group from the lst hour.There was no significant differences between Danshen group and Methylprednisolone grorp(P＞0.05).ConclusionCompound Danshen Injection has a protective effect on cell apoplosis of ratswith acute spinal cord injury.

Danshen;Acute spinal cord injury;Rats;Cell apoptosis

R683.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0111-03

▲通訊作者

2012-06-12 本文編輯：衛軻）