HPLC法測定阿達帕林凝膠中藥物的體外透皮吸收量

肖學成 陳鳳 李丹 李金

湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢 430065

HPLC法測定阿達帕林凝膠中藥物的體外透皮吸收量

肖學成 陳鳳 李丹 李金

湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢 430065

目的建立阿達帕林凝膠體外透皮接收液中藥物的HPLC測定方法，研究阿達帕林凝膠體外透皮能力。方法采用Global C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水-四氫呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸調節pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；檢測波長：270 nm。體外透皮實驗采用改良的Franz擴散池，以實驗用離體乳豬皮為透皮屏障，自制凝膠與市售凝膠的透皮結果對比，分別在不同時間點取樣測定透皮接收液中阿達帕林濃度，計算累積透皮量。結果阿達帕林的標準曲線方程為A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），線性范圍0.189～2.268μg/mL，平均回收率為99.93%。累積透皮吸收量與時間呈良好的線性關系，自制凝膠與市售凝膠的透皮結果差異無統計學意義。結論該檢測方法操作簡便，快速準確，是考察阿達帕林凝膠體外透皮性能的較理想的方法。

阿達帕林；透皮吸收；高效液相色譜法

阿達帕林（Adapalene，CD271）是一種新的萘甲酸衍生物，屬第三代維A酸類藥物，與維A酸相比其基本分子結構已被廣泛修飾。外用制劑為0.1%阿達帕林凝膠具有較好的抗炎，改善表皮角質形成細胞（角朊細胞）的分化能力，臨床顯示對痤瘡有良好療效，尤其適用于輕、中度痤瘡的治療[1]，較其他維A酸有更好地耐受性和更低的毒副作用[2]。因此準確有效地測定阿達帕林外透皮量具有重要意義，本研究建立了透皮接受液中阿達帕林的HPLC測定方法，研究了阿達帕林的體外透皮吸收情況，為臨床使用提供了實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH型恒溫電熱水浴器（上海互佳儀器設備有限公司）；HJ-5多功能磁力攪拌器（金壇市金祥龍電子有限公司）；改良的Franz立式擴散池[3]；戴安P680型高效液相色譜儀；ALC-110.4型電子天平（ACCULAB）。

1.2 試樣

市售阿達帕林凝膠（法國高德美藥業股份有限公司），批號：9051033；自制阿達帕林凝膠；0.9%NaCl水溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；四氫呋喃（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；阿達帕林對照品（中國藥品生物制品檢定所）。

1.3 動物

實驗用小型巴馬香豬：普通級，健康，雄性，2個月，體重5.8 kg，由重慶宗申醫達生物技術研發有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Global C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-四氫呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸調節pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量：20μL。

2.2 對照品儲備液的配制

精密稱定阿達帕林對照品30.08mg置于1 000mL容量瓶內，加生理鹽水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為30.08μg/mL的溶液，作為對照品儲備液。

2.3專屬性試驗

2.3.1 對照品溶液的制備

精密量取“2.2”項下對照品儲備液2 mL置于50 mL容量瓶中，加生理鹽水-無水乙醇（50∶50）溶解并稀釋至刻度，即為濃度為1.203 2μg/mL的對照品溶液。

2.3.2 樣品溶液的制備

稱取約為0.5 g的阿達帕林凝膠，將其均勻涂布于固定在Franz擴散池的豬皮上，12 h后取適量接收液通過孔徑為0.45μm的濾膜進行過濾，取續濾液作為樣品溶液。

2.3.3 空白基質液的制備

分別取上述對照品溶液、樣品溶液、空白基質液各20μL進樣，記錄色譜圖，結果見圖1。

結果表明在此色譜條件下，空白基質不會對皮膚產生影響，且空白基質在阿達帕林主峰處無吸收峰，故對阿達帕林的含量測定無干擾。

2.4 標準曲線的制備

精密量取“2.2”項下對照品儲備液各2、1、2、2、3、2 mL分別至250、100、100、50、50、25mL的量瓶中，加生理鹽水溶解搖勻并稀釋至刻度，得到一組濃度分別為0.240 64、0.300 80、0.601 60、1.203 20、1.804 80、2.406 40μg/mL的對照品溶液。分別進樣20μL，以濃度C（μg/mL）對峰面積A進行回歸，得阿達帕林標準曲線方程為A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），表明阿達帕林濃度在0.189～2.268μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗

取“2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續進樣測定6次。結果阿達帕林峰面積的RSD=0.82%。表明本方法測定阿達帕林的RSD值小于15%，在規定的范圍內，說明本測定方法的重現性良好。

2.6 穩定性試驗

由大學生對外賣服務的滿意情況與對市場未來前景觀點的交叉圖（見圖2）可以看出，隨著調查對象滿意程度的加強，他們對共享經濟在未來發展趨勢的樂觀度也隨之加強．

2.6.1 室溫條件將12 h樣品接收液于室溫下存放24 h，分別于0、4、6、8、12、24 h量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察透皮接收液在室溫條件下存放的穩定性，記錄結果：平均峰面積為0.843 7，RSD為1.41%。結果表明：透皮接收液在室溫條件下存放24 h內穩定。

2.6.2 冷藏（4℃）條件將12 h樣品接收液于冷藏（4℃）條件下存放7 d，分別于第1、2、3、4、5天同一時間量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察透皮接收液在冷藏（4℃）條件下存放的穩定性，記錄結果：平均峰面積為0.847 6，RSD為0.81%。結果表明：透皮接收液在冷藏（4℃）條件下存放5 d穩定。

2.7 回收率試驗

精密量取“2.2”項下對照品儲備液0.05、0.10、0.15 mL分別加入至空白接收液中，每種濃度各3份，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

低、中、高3種濃度回收率的平均值（99.93%）在85%～115%的范圍內，表明本測定方法的準確度高。因此，筆者所選擇的HPLC法適用于對阿達帕林透皮吸收的研究。

2.8 體外透皮實驗[4]

2.8.1 體外皮膚的制備將巴馬香豬用電動剪毛刀剪去腹部皮膚毛，12 h后處死，剝離皮膚（去毛部位），刮去皮下脂肪組織后用生理鹽水沖洗干凈，置于生理鹽水中浸泡約30min，

取出，用濾紙吸干備用。為了盡量消除不同部位動物皮膚可能導致的誤差。將每塊皮膚隨機分成兩半，一半用于市售凝膠透皮，另一半用自制凝膠透皮。

2.8.2透皮擴散裝置采用改進的Franz立體擴散裝置，接受遞質體積為14 mL，有效釋藥面積為4.7 cm2，（37±0.5）℃恒溫，攪拌速度為300 r/min。

2.8.3 實驗步驟將處理好的離體豬皮固定在于Franz立體擴散池上，角質層朝上，以皮膚恰好與液面接觸為好，將阿達帕林凝膠（約0.5 g）均勻涂布在豬皮上，在接收池中加生理鹽水14mL，用磁力攪拌器恒速攪拌接受液，使藥物自然釋放，保持恒溫水浴。分別于涂布后0.5、1、2、4、6、8、12 h定時取接受液1 mL，取樣后即向接受室內補充1mL生理鹽水。用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，取續濾液進樣測定，按下列公式[5]計算單位面積累積滲透量（Qn）：

式中Vo為接收液總體積，V為取樣量，qn為第n次實測單位面積滲透量（qn=樣品峰面積×對照品濃度×接收液取樣量/（對照品峰面積×釋放面積），qi為第n次前每次測得的單位面積滲透量。各時間點藥物單位面積累計滲透量見表1。以單位面積平均累積滲透量對時間進行線性回歸，擬合所得直線斜率即透皮速率（J）[6]。

2.8.4 實驗結果各時間點藥物單位面積累計滲透量見表2；以單位面積累積滲透量對時間進行線性回歸，所得直線斜率即透皮速率（J），結果見表3；對自制和市售兩處方的平均累積滲透量進行統計分析，結果見表4。

表2 兩處方的藥物單位面積累積滲透量（μg）

表3 兩種樣品單位面積累積滲透量（Q）及透皮速率分析

表4 兩種樣品平均累積滲透量的方差分析

結果表明，我公司生產的阿達帕林凝膠與原研廠家生產的阿達帕林凝膠在相同的擬定試驗條件下，2 h之前的透皮接收液均未檢出阿達帕林；7個取樣點的平均滲透量差異無統計學意義（P＞0.05），說明兩者的安全性和有效性差異無統計學意義。阿達帕林的累積滲透量與滲透時間呈良好的線性關系，表明阿達帕林的經皮滲透符合一級動力學過程。

3 討論

3.1 雜質對檢測結果的影響

在體外皮膚滲透實驗中，動物皮膚中的蛋白質的脫落或溶解不僅會污染接受液而且本身可能會有紫外吸收，在本研究中，波長270 nm處沒有任何干擾主藥測定的物質存在，因此，筆者采用檢測靈敏度較高的的HPLC測定吸收液中的阿達帕林的含量，排除了干擾，得到了基線分離，保證了實驗結果的準確。

3.2 接收液的處理

本實驗采用改進的的Franz立體擴散裝置考察阿達帕林凝膠體外透皮量，操作簡便，重復性好。為防止由于豬皮中蛋白質和脂質等大量生物大分子在接收液中溶出影響檢測結果、污染色譜柱，因此在進行HPLC檢測之前必須對接收液進行過濾。

3.3 試驗皮膚的選擇

研究藥物的透皮吸收最理想的方法是對人體做實際的研究。但人體皮膚難以獲得，且價格昂貴，因而應用動物皮膚進行透皮吸收研究具有實際意義。據報道豬與人的皮膚組織結構很相似，上皮修復再生，皮下脂肪層也相似，而且實驗證明2～3月齡的小豬皮膚解剖生理特點最接近于人[7]，所以選擇小豬皮膚作為透皮吸收研究模型是較理想的實驗動物模型。

3.4 自制阿達帕林凝膠的透皮性能

接受液中阿達帕林的含量測定結果表明，阿達帕林的累積滲透量隨時間的延長而增加，以Q對t進行線性回歸，說明其累積滲透量Q與t線性相關性較好。由測定結果可以看出，自制和市售凝膠的相關系數、透皮速率及12 h累積滲透量均非常平行，具有可比性。兩者的平均累積滲透量的方差分析結果顯示它們的平均累積滲透量差異無統計學意義（P> 0.05），即兩者透皮現象基本一致，表明兩者的治療效果相當。

[1]劉磊，張玉萍.阿達帕林凝膠治療輕、中度痤瘡療效觀察[J].中國實用醫藥，2006，1（4）：66-67.

[2]張錫寶，趙辨.阿達帕林（Adapalene）—治療痤瘡的新藥[J].中華皮膚科雜志，1999，28（12）：132

[3]丁承瑛，陸莉萍，王祥發.促進劑對雙氯芬酸貼片的透皮釋放作用[J].中國醫院藥學雜志，1998，18（5）：216.

[4]朱曉亮，李國鋒，曾抗，等.利多卡因納米乳制備及體外經皮吸收的實驗研究[J].南方醫科大學學報，2010，30（3）：451-454.

[5]王暉，高麗麗，徐銘，等.磷酸川芎嗪的體外透皮吸收[J].中草藥，2000，31（2）：117-119.

[6]翟光喜，王唯紅，陳曉，等.雌二醇軟膏體外透皮吸收的研究[J].山東醫藥工業，2001，20（6）：1-2.

[7]Bhatti AS，Scott RC.In-vitro percutaneos absorption：pig epidermal membrame as amoder for human skin[J].Pharm Pharmacol，1988，40（suppl）：45.

Determ ination of percutaneous absorption of Adapalene from Adapalene Gel by HPLC

XIAO Xuecheng CHEN Feng LIDan LIJin
College of Pharmacy,HubeiUniversity of Chinese Medicine,Hubei Province,Wuhan 430065,China

ObjectiveTo establish an HPLCmethod for quantitative determination of Adapalene in vitro percutaneous solution,and investigate the ability of percutaneous penetration of Adapalene Gel.MethodsGlobal C18column(250 mm× 4.6mm,5μm)was used as the fixed phase and amixture ofmethanol,purification water and tetrahydrofuran(86∶9∶5)as a mobile phase.The flow rate was 1.0mL/min.The detection wavelength was at 270 nm.Improved Franz type diffusion cells were used in vitro permeation studies and excised minipigs skins in vitro were used as transdermal barrier.The concentration of Adapalene in the receptor solution was determined by HPLC to investigate its cumulative permeation quantities at different time respectively and compared with that of the commercial gel.ResultsThe regression equation of Adapalene was linear in the range of 0.189-2.268μg/mL(A=1.031 88C-0.042 7,r=0.999 9).The average recovery was 99.93%.A good linear relationship existed betwen the cumulative penetration quantities and the time.There was no significant difference in the permeation quantities between the self-made and commercial gel.ConclusionThe method is simple,rapid, and accurate.It is a bettermethod to evaluate the characteristic of permeation for Adapalene.

Adapalene;Percutaneous absorption;HPLC

R927.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0120-03

2012-07-06 本文編輯：衛軻）